PTEN在铝毒性实验性阿尔茨海默病小鼠模型发生发展中的变化

摘要

目的： 在铝毒性拟阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)小鼠模型上，以小鼠学习记忆障碍以及脑组织出现老年斑(SP)及神经原纤维缠结(NFT)等AD特征性病理变化为指标反映AD样进展程度，从小鼠海马等脑组织中PTEN蛋白以及磷酸化PTEN蛋白水平、PTEN mRNA水平、PTEN样免疫阳性反应物表达与分布等研究层次，探索PTEN在AD样诱导发生发展过程中的动态变化及其与AD的关联，以深化理解AD发病机制，为AD的防治提供新的途径，为抗AD新药研发提供新的药物作用靶点。 方法： ①采用小鼠侧脑室注射0.5％A1Cl3溶液2μl，每天1次，连续5 d诱导出实验性AD模型，对照组注射等量的人工脑脊液； ②末次侧脑室注射后第2天、第7天采用避暗试验，第23～30天采用Morris水迷宫试验检测模型小鼠学习记忆能力； ③上述3个时间点行为学试验结束后，随即采用改良的硫磺素染色技术(Modified thioflavine S techniques，MTST)检测小鼠海马等脑组织内SP和。NFT等形成情况，RT-PCR测定小鼠海马组织内PTEN mRNA水平，Western blotting法测定其PTEN蛋白和磷酸化PTEN蛋白水平； ④同上方案制作另一批铝毒性拟AD小鼠模型，分别于末次侧脑室注射后第7、14、21、28、35天，以免疫组织化学法观测PTEN样免疫阳性反应物在小鼠海马等脑组织内的表达与分布。 结果： 1.铝毒性实验性AD小鼠模型的建立： ①上述末次侧脑室注射后第2天，模型组小鼠相比对照组逃避潜伏期和错误次数未见明显差异； ②侧脑室注射后第7天，对照组小鼠逃避潜伏期较第2天显著延长(P<0.001)，错误次数减少；而模型组小鼠潜伏期未见明显变化，错误次数增加，双因素统计分析显示模型组小鼠逃避记忆能力随时间进行受铝毒的影响显著下降(铝毒处理和时间交互作用，P<0.05)； ③侧脑室注射后第23～30天，在Morris水迷宫试验中，模型组小鼠定向航行平均成绩显著低于对照组(P<0.001)，空间探索目标象限滞留时间显著低于对照组(P<0.05)，表明模型组小鼠空间学习记忆能力显著受损； ④在上述3个时间点行为学试验结束后，每组立即取2～3只小鼠断头取脑，MTST染色可见于侧脑室注射后第30天模型组小鼠大脑颞区皮质有老年斑和神经原纤维缠结类似结构。 2.铝毒性拟AD小鼠海马组织中PTEN mRNA水平的变化：在上述3个时间点行为学试验结束后，每组立即取4～5只小鼠断头取脑，分离全海马并提取总RNA，行RT-PCR测定海马组织中PTEN mRNA水平，结果显示第2、7天模型组与对照组无明显差异，第30天模型组mRNA水平显著低于对照组(P<0.05，1-tailed)。 3.铝毒性拟AD小鼠海马组织中PTEN蛋白和磷酸化PTEN蛋白水平的变化：在上述3个时间点行为学试验结束后，每组立即取4～5只小鼠断头取脑，分离全海马行 ①Western blotting测定海马组织PTEN蛋白水平，结果见上述3个时间点模型组均略高于对照组，但无显著差异； ②Western blotting测定海马组织中磷酸化PTEN-Ser380蛋白水平，侧脑室注射后第2、7天模型组与对照组未见明显差异，第30天模型组磷酸化PTEN-Ser380蛋白水平显著低于对照组(P<0.05)。 4.铝毒性拟AD小鼠发生发展过程中脑组织PTEN样免疫阳性反应物表达与分布的变化状况： ①海马组织：镜下观察可见，PTEN样免疫阳性反应物在小鼠海马CAl、CA2、CA3锥体层细胞及齿状回颗粒细胞存在高丰度表达；上述侧脑室末次注射后第7、14、21、28、35天，模型组小鼠海马CAl区锥体层神经元内PTEN样免疫阳性反应强度相比对照组存在变化，而在CA2、CA3区锥体层细胞及齿状回颗粒细胞未见明显变化。以免疫组化专用分析软件选择测定CAl区锥体层灰度值，结果表明，侧脑室末次注射后第7天模型组小鼠海马CAl区锥体神经元PTEN样免疫阳性反应强度显著高于对照组(﹡﹡P<0.01)；第14天仍高于对照组(*P<0.05)；第21、28天与对照组相比无显著差异；第35天显著低于对照组(*P<0.05)。 ②大脑皮质组织：镜下观察可见，PTEN样免疫阳性反应物在大脑皮质锥体神经元高丰度表达，颗粒层及多形细胞层弱阳性表达。上述侧脑室末次注射后第7、14、21、28、35天，模型组小鼠大脑皮质颞区第Ⅲ层锥体神经元PTEN样免疫阳性反应强度相比对照组存在变化。以免疫组化专用分析软件选择测定大脑皮质颞区第山层锥体神经元灰度值，结果显示，模型组小鼠大脑皮质颞区第Ⅲ层锥体神经元PTEN样免疫阳性反应强度呈阶段性变化，侧脑室末次注射后第7天模型组和对照组比较无显著差异；第14天模型组显著强于对照组(﹡﹡P<0.01)；第21、28和35天模型组均显著弱于对照组(﹡P<0.05)。 结论： 1.侧脑室注射 A1C13可致小鼠学习记忆能力显著受损，大脑颞区皮质在模型发展的后期可出现SPs和NFTs，提示铝毒性小鼠可作为拟AD动物研究模型，其发展呈进行性加重。 2.铝毒性拟AD小鼠发生发展后期，其海马组织PTEN mRNA水平、磷酸化PTEN蛋白水平显著下降。 3.在铝毒性拟AD小鼠发生发展过程中，PTEN在海马CAl区和大脑皮质颞区第Ⅲ层锥体神经元内的表达呈现动态变化，发生期表达增强，而发展后期及形成期表达减弱。

目录

论文说明：英文缩写字表

声明

一.中文摘要

二.英文摘要

三.前言

四.材料与方法

1.材料

1.1动物

1.2药品和试剂

1.3仪器

2.方法

2.1总的实验技术路线方案

2.2小鼠侧脑室埋管及微量注射

2.3避暗试验

2.4 Morris水迷宫试验

2.5改良的硫磺素染色技术

2.6 RT-PCR

2.7 Western Blotting

2.8免疫组织化学法

2.9统计分析

2.10有关溶液的配制

五.结果

1.铝毒性实验性AD小鼠模型的建立

1.1铝毒拟AD小鼠被动逃避反应能力的变化

1.2铝毒拟AD小鼠空间学习记忆能力的变化

1.3铝毒拟AD小鼠发生发展过程中小鼠脑组织的病理变化

2.铝毒拟AD小鼠发生发展过程中海马组织PTEN表达水平的变化

2.1 PTEN mRNA水平的变化

2.2 PTEN蛋白水平的变化

2.3磷酸化PTEN蛋白水平的变化

3.铝毒性拟AD小鼠发生发展过程中脑组织PTEN表达与分布的变化状况

3.1海马内PTEN样免疫阳性反应物的分布与强度的变化

3.2大脑皮质中PTEN样免疫阳性反应物的分布与强度的变化

六.讨论

1.铝毒性拟AD小鼠研究模型

2.AD发生发展过程中PTEN的变化

3.PTEN在AD发生中的可能作用及其影响因素分析

七.结论

八.参考文献

九.附录

十.致谢

十一.综述：阿尔茨海默病实验性动物模型的研究进展