利用SELEX技术筛选金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)适体的研究及应用

摘要

目的:利用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术，从体外合成的全长96bp其中包含60bp的随机序列的寡核苷酸文库中筛选出与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)高亲和力高特异性结合的适体。并利用筛选出的适体建立酶连接适体免疫吸附检测法和胶体金标记适体的双适体夹心斑点渗滤法用于快速鉴定SEB；同时对适体在体外抑制SEB超抗原活性的功能进行研究。 方法: 1.在体外构建两端为固定序列，中间为60bp的随机序列，全长96bp的寡核苷酸文库。以SEB为靶标，利用SELEX筛选技术，筛选出针对SEB高亲和力高特异性的适体群，建立了适体标记荧光直接检测法(aptamer labelledfluorescence direct assay，ALFDA)进行各轮ssDNA富集库与SEB的结合力测定。 2.以地高辛—碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体系统作为桥连，间接连接酶与核酸，通过酶促底物显色反应测定吸光度A值，对筛选出的适体群与SEB的结合力和部分相关蛋白进行比较。同时利用该法测定了系列浓度的适体与SEB的结合力数据，通过软件获得解离常数Kd值进一步鉴定了适体与靶标的亲和力。适体标记胶体金颗粒后，以斑点渗滤法为基础鉴定筛选出适体的特异性。 3.将第11轮筛选产物分别进行扩增、纯化，TA克隆、测序并用相关软件分析其一级和二级结构。 4.微孔板包被抗SEB抗体作为捕获分子，以酶桥连适体作为检测信号建立的酶连适体免疫混合吸附法用于SEB的定量检测。同时将针对SEB特异性适体包被在硝酸纤维素膜上作为捕获分子，以胶体金标记的适体作为报告分子，建立了金标双适体夹心斑点渗滤法。 5.分析适体在体外对于SEB超抗原的功能学抑制作用。系列浓度的适体作用SEB后刺激人外周血单核淋巴细胞，利用MTT法测定PBMC的吸光度A值，并通过刺激指数(SI)分析增殖活性；同时利用ELISA检测IFN-γ的分泌情况。 结果: 1.随着筛选轮数的增加，SEB与ssDNA富集库的结合力也显著增高。13轮后结合力从最初的1.1％上升至39.8％，提高了36倍。当ssDNA富集库与SEB的结合位点达到一个饱和状态时，吸附到靶标上的ssDNA就不再增加。 2.利用酶连接核酸的酶促显色反应测定A值，鉴定适体与SEB的结合能力，结果显示筛选出的适体与SEB反应后的吸光度值为1.02，明显高于SPA的0.35、BSA的0.32，和空白对照0.28。通过软件分析，适体与SEB的解离常数Kd值可低至21.9nM。金标适体能够特异性识别结合SEB，膜上呈现阳性反应，结果与酶连接核酸结果相符合。 3.11轮产物进行克隆测序，经序列比对后发现25个测定序列中有两对序列明显富集，几乎完全一致，同源性达95％以上，利用Chromas和DNAman软件进行序列分析一级结构，按照同源性分成7个家族，利用DINAMelt sever软件分别模拟出7个家族的二级结构主要以茎环、G—四聚体为主。 4.建立了酶连接适体免疫吸附混合检测法用于测定SEB的定量检测，当SEB浓度在0.1～20ug/ml具有较好的线性关系。利用双适体夹心斑点渗滤法对SEB进行定性检测，SEB被特异性适体捕获后，与金标适体反应膜上可出现红色斑点，而SPA、BSA、正常血清和空白对照均无颜色变化。 5.适体在体外对SEB的功能学研究发现，当适体浓度达到200nmol/L时，PBMC的SI值降低至1.03，IFN—γ分泌量减少至25ng/ml，差异具有明显的统计学意义。细胞实验显示适体对SEB促PBMC增殖的超抗原活性具有一定的抑制作用。 结论: 本研究运用指数富集配基的系统进化(SELEX)技术，成功筛选到针对SEB的高亲和力和高特异性的ssDNA适体群。利用筛选到的针对SEB特异性适体群，建立酶连接适体免疫混合夹心法和金标双适体夹心斑点渗滤法用于SEB定量、定性快速检测；具有良好的灵敏度与特异性。通过细胞增殖试验和细胞因子定量分析显示适体在体外对SEB的超抗原活性具有明显的抑制作用。利用SELEX技术筛选SEB特异性适体为感染金黄色葡萄球菌产生SEB的临床快速鉴定和治疗带来了希望。

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文摘

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论文说明：英文缩略词表

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引言

第一部分 利用SELEX技术筛选金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)特异性适体

一.材料和方法

二.结果

三.讨论

小结

第二部分 适体亲和力、特异性分析

一.材料和方法

二.结果

三讨论

小结

第三部分 适体的鉴定、分析

一.材料和方法

二.结果

三讨论

小结

第四部分 利用筛选出的SEB特异性适体建立检测方法学

一.材料和方法

二.结果

三.讨论

小结

第五部分 适体对SEB功能的抑制作用

一.材料和方法

二.结果

三.讨论

小结

参考文献

综述功能性适体传感器应用的研究进展