小鼠卵巢组织的玻璃化冷冻保存技术研究

摘要

卵巢组织冷冻保存技术是生殖工程的重要侧面之一，可为受精机制研究和体细胞核移植研究等需要储备和供应卵源的课题提供技术保障。迄今为止，卵巢组织的冷冻保存虽然已取得了一系列进展但技术仍不完善，玻璃化冷冻方法为生物组织保存提供了新的途径，但尚未形成完善的技术体系。 冷冻操作方法和冷冻保护液是影响玻璃化冷冻效果的两个重要因素。在以往的研究中，冷冻复苏的卵母细胞和卵巢组织都有部分能够发育到囊胚或者生育幼仔，说明冷冻复苏后的卵母细胞及或各级卵泡保持了正常的发育潜能。但是，采用常规程序冷冻法和常规玻璃化冷冻法保存的卵巢组织，或者复苏率不高，或者方法繁琐，而且对分离的窦前卵泡的冷冻保存研究较少。本研究采用分离卵泡为材料分别研究了不同的玻璃化冷冻操作方法和不同的冷冻保护液配方，并对小鼠卵巢组织片进行玻璃化冷冻试验。采用从小鼠卵巢分离的窦前卵泡为材料，采用Dinnyes等相同的玻璃化冷冻保护液，比较了常规玻璃化法、液氮网篮法、-205℃玻璃化法、-205℃表面玻璃化法4种不同操作方法的冷冻保护效果；之后，采用上述实验获得的最佳冷冻方法，选择三种玻璃化冷冻保护剂配方，冷冻保存从小鼠卵巢分离的窦前卵泡，比较各种配方的冷冻效果，探索建立适宜的窦前卵泡快速玻璃化冷冻保存方法和选择合适的玻璃化冷冻保护液。在此基础上，进一步冷冻小鼠卵巢组织块，观察复苏后分离卵泡的存活率和贴壁率。 结果显示： (1)在冷冻操作方法研究方面，实验A中，采用液氮网篮和-205℃玻璃化两种冷冻方法的卵泡复苏率明显高于常规玻璃化的复苏率，而两者之间无差异；实验B中，采用-205℃表面玻璃化和液氮网篮两种方法冷冻的卵泡复苏率有显著性差异，-205℃表面玻璃化和-205℃玻璃化两种方法冷冻的卵泡复苏率有显著性差异，而液氮网篮和-205℃玻璃化冷冻的卵泡复苏率无差异，-205℃表面玻璃化方法冷冻小鼠窦前卵泡复苏率达83.02％±4.10％。 (2)在冷冻保护液研究方面，比较了三种玻璃化冷冻保护液冷冻保存小鼠窦前卵泡的复苏率，两两之间均有显著性差异。其中冷冻保护液A的复苏率为18.54％，标准差(SD)为2.65，变异系数(CV)为14.27；冷冻保护液B的复苏率为98.39％，标准差(SD)为1.88，变异系数(CV)为1.91；冷冻保护液C的复苏率为5.83％，标准差(SD)为0.38，变异系数(CV)为6.57。冷冻保护液B的冷冻保存效果最好。 (3)在小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存方面，复苏后卵巢组织需要孵育一段时间才能恢复生长发育功能，孵育的时间不同，对其分离卵泡的复苏率和贴壁率亦不同。孵育48h的卵巢组织块分离卵泡后的卵复苏率和贴壁率较高。 综上所述，得出以下结论： 1.-205℃表面玻璃化是迄今最好的冷冻小鼠窦前卵泡的方法。 2.冷冻保护液B(EFS)是一种优异的小鼠窦前卵泡的玻璃化冷冻保护液。 3.采用冷冻保护液B和-205℃表面玻璃化冷冻保存小鼠卵巢组织块，可较好地保持卵巢组织的结构与功能。 4.卵巢组织冷冻复苏后需要进一步孵育才适合进一步处理。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

材料与方法

一、技术路线

二、材料

(一)主要仪器及设备

(二)主要试剂及配制

(三)动物

三、实验方法

(一)冷冻操作方法对小鼠窦前卵泡的影响

(二)冷冻保护液对小鼠窦前卵泡的影响

(三)小鼠卵巢组织的玻璃化冷冻和复苏

(四)数据统计学分析

结果

讨论

结论

参考文献

综述：卵巢组织的玻璃化冷冻研究进展

致谢