脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞治疗坐骨神经损伤

摘要

第一部分BDNF基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞构建及鉴定 目的：将携带大鼠BDNF基因之慢病毒载体感染大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stem cells，rMSCs)，获得有生物活性BDNF修饰的rMSCs(BDNF-rMSCs)。 方法：将本实验室已构建好的质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP，在脂质体介导下与包装质粒HELPER，包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。提取新鲜骨髓，体外分离rMSCs并培养、鉴定。浓缩病毒测定滴度后感染2～4代rMSCs，荧光激发及细胞免疫组织化学以鉴定。(本方法是按福建医科大学附一医院神研所张志坚课题组关于BDNF基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞构建及鉴定的方法和步骤进行。) 结果：三质粒共转染293T细胞后荧光激发可见大量绿色荧光。收集、浓缩病毒后测定滴度为6.5×107 TU/mL，提取的病毒经PCR证实BDNF基因已成功插入。病毒感染rMSCs后荧光激发可见绿色荧光，细胞免疫组织化学检测有BDNF蛋白表达。 结论：成功获得BDNF-rMSCs基因工程干细胞，该细胞可大量表达BDNF蛋白，为下一步BDNF-rMSCs移植治疗坐骨神经损伤奠定了基础。 第二部分BDNF-rMSCs基因工程干细胞对坐骨神经损伤的治疗作用 目的：观察植入脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞后坐骨神经损伤大鼠神经纤维的再生及运动功能的恢复情况。 方法：180只成年F344大鼠，采用钳夹法制作成右坐骨神经损伤模型，随机分为磷酸盐缓冲液组(PBS组)，骨髓间质干细胞组(空载体-rMSCs组)，脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞组(BDNF-rMSCs组)。各组在损伤处分别注射磷酸盐缓冲液2μL，骨髓间质干细胞混悬液2μL和脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞混悬液2μL。在移植术后2，4周，通过辣根过氧化物酶示踪观察损伤侧L4.5脊髓前角存活的神经细胞数目，通过测量坐骨神经功能指数值观察大鼠损伤侧肢体运动功能恢复情况，同时应用荧光激发及免疫组化技术检测骨髓间质干细胞存活和脑源性神经营养因子表达情况。 结果：BDNF-rMSCs组损伤侧L4.5脊髓前角细胞的存活数目多于PBS组，空载体-rMSCs组，并且神经功能恢复也比这两组好。空载体-rMSCs组，BDNF-rMSCs组可观察到神经损伤处有较多的骨髓间质干细胞存活，并且BDNF-rMSCs组脑源性神经营养因子表达明显比空载体-rMSCs组多。 结论：脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间质干细胞移植对周围神经损伤后神经功能恢复有促进作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分BDNF基因修饰的大鼠骨髓间质干细胞构建及鉴定

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

第二部分BDNF-rMSCs基因工程干细胞对坐骨神经损伤的治疗作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、小结

结论

参考文献

综述 周围神经损伤与BDNF基因修饰的骨髓基质细胞的修复

附录：本人在研究生学习期间发表文章

致谢