Hes1和Hes5表达与人神经胶质瘤细胞增殖能力相关性的研究

摘要

目的： 1、探讨Notchl受体和其下游信号分子Hes1、Hes5在神经胶质瘤中表达特点和相互关系； 2、构建Hes1、Hes5基因RNAi慢病毒载体，筛选获得Hes1、Hes5沉默的神经胶质瘤细胞株； 3、观察Hes1、Hes5基因沉默对神经胶质细胞U251增殖的影响，初步探讨Notch-Hes信号通路调控神经胶质瘤增殖的可能机制。 方法： 1、应用免疫组织化学方法检测人脑星形细胞瘤和正常人脑组织中Notchl和Hes1、Hes5表达情况； 2、设计、合成针对靶基因Hes1、Hes5的shRNA编码序列，将其克隆到pENTR/U6 RNAi入门载体，经瞬时转染筛选获得有效的靶序列。将含有Hes1、Hes5有效干扰序列的入门载体与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST目的载体通过GatewayLR重组构建出相应的shRNA慢病毒表达载体，经293FT细胞包装获得慢病毒颗粒。通过慢病毒转导U251细胞后，筛选获得Hes1、Hes5基因沉默的U251细胞株； 3、采用MTT法，平板克隆形成实验，流式细胞术检测Hes1、Hes5基因沉默对U251细胞增殖及细胞周期的影响。 结果： 1、人脑星形细胞瘤中Notchl、Hes1和Hes5的表达均显著强于正常脑组织：在不同病理分级的星形细胞瘤中，Ⅱ～Ⅲ级组Notchl和Hes1的表达水平显著高于Ⅳ级星形细胞瘤组，Hes5的表达在两组间无显著性差异。星形细胞瘤中Notchl与Hes1的表达有较好的一致性，与Hes5的表达一致性较差。 2、成功筛选出Hes1、Hes5基因特异、有效的RNA干扰靶点，构建了针对Hes1、Hes5基因特异性shRNA慢病毒表达载体，并在293FT细胞中包装获得慢病毒颗粒，病毒滴度分别为8.4×104TU/ml、7.2×104TU/ml。 3、建立了Hes1、Hes5基因稳定沉默的神经胶质瘤U251细胞株。 4、沉默Hes1或Hes5均能明显抑制U251细胞增殖及克隆形成能力。 结论： 1、Notchl表达与星形细胞瘤的发生有关，与星形细胞瘤的病理分级无关。Notchl可能主要是通过下游分子Hes1而非Hes5发挥作用。 2、构建的Hes1、Hes5特异性RNAi慢病毒表达载体能有效抑制胶质瘤细胞U251中Hes1、Hes5基因的表达，可作为研究Notch-Hes信号通路及其与胶质瘤关系的重要技术手段。 3、Hes1、Hes5与胶质瘤细胞的增殖密切相关，在体外Hes1、Hes5特异性RNAi能够抑制胶质瘤细胞U251的增殖能力。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分Notch1和Hes1、Hes5在星形胶质细胞瘤中的表达及其相关性研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

第二部分Hes1、Hes5基因RNAi慢病毒载体的构建及病毒包装

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

第三部分Hes1、Hes5基因稳定沉默的U251胶质瘤细胞株的建立

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

第四部分Hes1、Hes5基因沉默对神经胶质瘤细胞U251增殖的的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

综述 Notch信号通路与脑胶质瘤的研究进展

致谢