舟山眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶的分离纯化及对体内外抗血管生成作用

摘要

L-氨基酸氧化酶(ECl.4.3.2)是一类以FAD为辅基的黄素蛋白酶，能立体特异性催化L-氨基酸氧化脱氨生成α-酮酸、H2O2和氨[1]。L-氨基酸氧化酶在蛇毒中分布非常广泛，是蛇毒中一种重要的组分，并有众多的生物学活性如：诱导或抑制血小板聚集、细胞毒性、抗菌活性、抗肿瘤作用等。蛇毒中的酶虽然不是蛇毒的主要毒性成分，但它与蛇伤后引起的出血肿胀、组织坏死、伤口溃烂等有密切的关系。近来一些研究表明，蛇毒中的L-氨基酸氧化酶能够诱导细胞凋亡，还能影响血小板功能，被蛇特别是眼镜蛇和蝮蛇咬伤后伤口血流不止等提示L-氨基酸氧化酶可能诱导血管内皮细胞凋亡，对新生血管的生长有一定的影响。本课题通过优化舟山眼镜蛇毒的L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase of Naja atravenom，NAV-LAO)的酶活性测定方法、分离纯化，观察NAV-LAO对人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)的增殖影响、体外小管形成及鸡胚尿囊膜新生血管生成等的影响，为蛇毒L-氨基酸氧化酶的进一步研发提供实验依据。 1.NAV-LAO活性测定方法优化 采用邻联茴香胺(ODA)、邻苯二胺(OPD)和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)三种供氢体测定NAV-LAO的活性并比较它们灵敏度和重复性。OPD方法的灵敏度在浓度1.0-0.0025mg·ml-1范围内显著高于其他两种方法(p<0.05或p<0.01)，且其RSD为2.1％说明其重复性较好。 2.NAV-LAO的分离纯化及部分理化性质测定 眼镜蛇毒粗毒经过SP-Sepharose FF阳离子交换色谱，获得13个蛋白质组分。采用OPD检测方法，对各洗脱峰进行L-氨基酸氧化酶活性测定，发现组分I具有L-氨基酸氧化酶活性，收集含有L-氨基酸氧化酶活性的组分。将I组分过Heparin Sepharose CL-6B肝素亲和层析色谱纯化得到一个NAV-LAO纯品。NAV-LAO经12％SDS-PAGE电泳为一条清晰的蛋白带，在SDS-PAGE凝胶电泳中，不论是还原还是非还原其电泳均为一条带，说明NA-LAO为单链蛋白，相对分子质量约58kD。 3.NAV-LAO对人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)细胞生长的影响 采用MTT法观察NAV-LAO对人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞增殖的抑制作用。结果显示NAV-LAO呈剂量依赖性的抑制细胞的生长，NAV-LAO作用24h对于HUVEC细胞的IC50为21.42μg/ml。 4.NAV-LAO对HUVEC细胞移动能力的影响 划痕实验检测NAV-LAO对HUVEC细胞迁移能力的影响。在原始致伤区的基础上，与未用药组比较，实验组细胞的运动能力明显下降，与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。 5.NAV-LAO对HUVEC细胞体外小管形成的影响 采用小管形成实验观察NAV-LAO对内皮细胞的抗血管生成作用，通过比较管腔形成个数、面积、周长，发现NAV-LAO抑制HUVEC细胞管腔形成，并且这种作用呈剂量依赖关系。 6.Hoechst33342观察NAV-LAO对HUVEC细胞凋亡的影响 NAV-LAO作用HUVEC细胞后，经Hoechst33342核荧光染色，发现药物作用后凋亡细胞显著多于对照组，并且发生凋亡的细胞体积缩小，胞核浓缩、靠边、深染，并可见凋亡小体。 7.NAV-LAO对HUVEC细胞caspase3、caspase8表达量的影响 Western Blotting分析不同浓度NAV-LAO处理HUVEC细胞24h后，caspase3、caspase8的表达量的变化。结果发现caspase3、caspase8表达量均较对照组增加，且呈一定的剂量相关性。 8.NAV-LAO对鸡胚尿囊膜(Chick Chorioallantoic membrane，CAM)血管生成的影响 选用鸡胚尿囊膜模型观察NAV-LAO对鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用，采用测量区血管面积与测量区面积的比值(VA/CAM)评价抑制程度。结果显示的NAV-LAO组(μg)处理后可见鸡胚CAM血管形态基本正常，呈树状分布，但分布稀疏，与PBS组相比VA/CAM显著减少(P<0.01)。其中PBS组VA/CAM(％)为45.75±7.12，而NAV-LAO3.2μg、6.5μg、12.9μg，其VA/CAM(％)分别为32.35±3.83，23.66±2.72，18.48±2.29；阳性对照组Dex75μg VA/CAM(％)为17.43±2.52，通过以上数据显示，NAV-LAO在低浓度就具有抑制血管生成作用。 结论：采用OPD方法检测L-氨基酸氧化酶具有较高的灵敏度和重复性。通过两步层析从舟山眼镜蛇毒中分离得到一个L-氨基酸氧化酶纯品NAV-LAO，分子量为58KD。通过体内外实验发现NAV-LAO具有抗血管生成作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

Ⅰ.NAV-LAO酶活性测定方法的优化及分离纯化

材料和方法

1.材料

2.方法

3结果

4讨论

Ⅱ.NAV-LAO的活性测定

材料与方法

1.材料

2.方法

结果

3.结果

讨论

结论

参考文献

致谢

综述 蛇素养L-氨基酸氧化酶的研究进展