PTEN在拟阿尔茨海默病样细胞模型发生中的变化及作用

摘要

阿尔茨海默病(AD)，是与年龄高度相关的原发性神经退行性疾病，以神经原纤维缠结(NFT)形成和老年斑(SP)为主要病理特征。AD的病因和发病机制迄今尚不清楚，临床上也缺乏根本有效的治疗手段，因此有关AD发病机制的探索以及新的药物作用靶点或有效的干预环节的寻找，是当今AD研究的热点。 PTEN属蛋白酪氨酸磷酸酶，具有脂质和蛋白质双重特异性磷酸酶活性，是细胞信号转导的重要调节分子，它与细胞的生长、分化、凋亡调控等方面都有密切的关系。随着近年来人们对PTEN认识的不断增加，PTEN在中枢神经系统，尤其是中枢神经系统损伤性疾病发生发展中的作用也日益受到重视。但是，PTEN与AD发生发展的关联及其意义有待于探索。
　　 本研究探索了PTEN在拟AD样细胞模型发生发展中的变化状况。首次观察到，在冈田酸(Okadaic acid，OA)诱导的拟AD样细胞模型的发生发展中，PTEN蛋白水平呈现动态变化，即随着细胞损伤程度的加重和磷酸化tau蛋白水平的改变，PTEN蛋白水平表现出先升高后下降的现象，提示PTEN可能在AD的发病机制中起着一定的作用。在此基础上，本课题首先在4个不同诱导因素诱导建立的拟AD样细胞模型中，通过观察PTEN蛋白水平、PTENmRNA的动态变化以进一步明确PTEN在AD发生发展过程中的变化规律；进而采用慢病毒介导的RNA干扰技术阻断PTEN基因表达，分析其对冈田酸诱导的SH-SY5Y细胞拟AD样细胞模型发生中细胞损伤和tau(Ser396)蛋白过度磷酸化的影响，探索下调PTEN基因表达在AD样细胞模型发生中的作用；进而探索其作用的可能分子机制，以期深化理解AD的发病机制，为AD防治的新途径和抗AD新的药物靶点的研发提供理论和实验依据。本实验主要研究内容包括以下两个部分：
　　 ㈠PTEN在拟阿尔茨海默病样细胞模型发生发展中的变化。
　　 分别以OA和β淀粉样蛋白多肽25-35(β-amyloid peptide25-35，Aβ25-35)诱导SH-SY5Y细胞或SD大鼠胎鼠的皮层神经元原代细胞，建立拟AD样细胞模型，以细胞形态、磷酸化tau蛋白水平的变化作为反映细胞AD样指标，探讨AD样细胞模型诱导发生发展过程中PTEN蛋白水平、PTEN mRNA水平的变化规律，并分析其与细胞AD样发生发展的关联。结果表明，在4个AD样实验性细胞模型中均观察到OA或Aβ25-35所致的细胞皱缩、突起中断等细胞进行性损伤的形态学变化，磷酸化tau蛋白[p-tau(Ser396)]水平均呈现先缓慢升高后下降的变化，提示拟AD样细胞模型建立成功；1)在40 nmol/L OA诱导SH-SY5Y细胞的拟AD样细胞模型中，给予OA后3 h PTEN蛋白水平开始升高，6 h达到高峰，随后逐渐下降，48 h时PTEN蛋白水平低于0 h，但无显著性差异；PTENmRNA表达水平也表现为升高，6 h即明显升高，24 h达高峰，随后略有下降，但至48 h仍明显高于0 h(P＜0.01)。2)40μmol/L Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞时，PTEN蛋白水平3 h开始升高，12 h达高峰后逐渐下降，48 h时接近0 h值；PTEN mRNA表达水平6 h时下降，随后升高，12 h达高峰后略有下降，但48 h时仍高于0 h值(P＜0.01)。3)20 nmol/L OA诱导大鼠胎鼠原代神经元细胞，PTEN蛋白水平3 h开始升高，12 h达到高峰，随后逐渐下降，48 h时PTEN蛋白水平明显低于0 h(P＜0.01)。4)20μmol/L Aβ25-35诱导大鼠胎鼠原代神经元细胞，Aβ25-35诱导后PTEN蛋白水平升高，6 h达到高峰随后下降，24 h的PTEN水平低于0 h(P＜0.01)。上述结果提示，在4个AD样细胞模型发生发展中，PTEN表达均呈现先增强后减弱的动态变化，且PTEN蛋白水平的升高先于磷酸化tau(Ser396)蛋白水平的升高，提示PTEN与AD的发生发展可能具有一定的关联性，AD发生早期PTEN表达可能增强。
　　 ㈡下调PTEN基因表达对OA所致SH-SY5Y细胞tau蛋白异常磷酸化的影响及可能的分子机制。
　　 针对人PTEN基因的RNA干扰慢病毒颗粒和携带GFP的阴性慢病毒颗粒感染SH-SY5Y细胞，通过westem-blot法和实时定量PCR技术鉴定PTEN基因的干扰效率约达到86.7％。采用40 nmol/L OA诱导细胞24 h建立拟AD样细胞模型，与未感染组细胞和感染阴性病毒载体的细胞相比，下调PTEN基因表达的细胞对于OA所致的细胞损伤具有一定的保护作用，表现为细胞形态改善，细胞活力增强，细胞内Ser396位点磷酸化tau蛋白的水平显著降低(P＜0.05)。接着通过观察PI3K/Akt信号通路及其下游GSK-3β蛋白水平的变化对PTEN和Ser396位点磷酸化tau蛋白之间的关联进行探讨，发现下调了PTEN基因表达的SH-SY5Y细胞在OA孵育24 h后，与阴性对照组相比其Akt的活化形式p-Akt(Ser473)蛋白表达水平增加，PI3K/Akt信号通路激活，进而使p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平升高而抑制GSK-3β的活性，使磷酸化tau(Ser396)蛋白水平降低。
　　 本研究表明：⑴在AD样细胞模型发生发展过程中，PTEN表达呈现先增强后减弱的动态变化，且PTEN蛋白水平的升高先于磷酸化tau(Ser396)蛋白水平的升高，提示PTEN与AD发生发展可能具有一定的关联性，AD发生早期PTEN表达可能增强。⑵慢病毒介导的RNA干扰抑制PTEN基因表达可对抗OA诱导的tau(Ser396)蛋白异常磷酸化等AD样变化，提示PTEN表达增强可能具有促进AD发生的作用。⑶PTEN对OA诱导的tau(Ser396)蛋白异常磷酸化的作用可能通过PI3K/Akt信号通路途径及其下游的GSK-3β进行调控。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分PTEN在拟阿尔茨海默病样细胞模型发生发展中的变化

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分下调PTEN基因表达对冈田酸所致SH-SY5Y细胞tau蛋白异常磷酸化的影响及其可能的分子机制

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

结 论

参考文献

致 谢

综述 PTEN在中枢神经系统疾病发生中的可能作用

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