肠球菌efaA基因阳性转化株的构建及其对生物膜形成影响的初步探讨

摘要

目的：构建pAT28+efaA+His重组子和肠球菌efaA-对照株及efaA+转化株，为进一步探讨efaA基因的功能，防治肠球菌感染奠定基础。
　　 方法：
　　 一、肠球菌efaA-对照株及efaA+转化株的构建及鉴定：
　　 1.用PCR从肠球菌标本中筛选出efaA-/gel-/cyl-野生株(本实验室保存)；
　　 2.用氯化钙共沉淀法将空质粒pAT28转化到野生株作为对照株；
　　 3.构建pAT28+efaA重组子并转化到野生株做为转化株：Genebank中获得efaA基因全长，PCR扩增efaA基因片段，用基因克隆技术构建pAT28+efaA重组载体，用氯化钙共沉淀法将重组子转化至E.coli DH5α，经蓝白斑筛、PCR鉴定、双酶切鉴定、测序，将测序正确的重组子转化到野生株做为转化株，IPTG诱导efaA基因表达， SDS-PAGE、Western Blot分析鉴定。
　　 二、efaA基因对肠球菌生物膜形成影响的初步探讨
　　 用半定量可见光测定OD值的方法检测efaA-野生株、空质粒pAT28对照株以及efaA+转化株(大约5×106-10×106 CFU)在96孔板分别静止培养3 h、24 h后形成的生物膜OD595，通过比较efaA基因转化入肠球菌野生株前后生物膜形成能力差异，探讨efaA基因对生物膜形成的影响。
　　 结果：1.对照株(空质粒pAT28转野生株)在含壮观霉素(终浓度500μg/ml)的ELB培养平板上培养可见菌落生长；转化株(pAT28+efaA重组子转野生株)在IPTG/X-Gal的壮观霉素(终浓度500μg/ml)ELB培养平板上培养，可见白色菌落生长，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE、Western Blot分析，可见在35kd附近有一条带；2.早期黏附测定与生物膜形成实验中，转化株粘附在96-孔板底部形成的生物膜OD595值均比野生株及对照株大。
　　 结论：1.成功构建出肠球菌efaA-对照株及efaA+转化株；2.efaA基因有利于肠球菌早期黏附与生物膜形成。

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材料和方法

结果

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参考文献

致谢

综述 肠球菌生物膜的研究