基底外侧杏仁核的长时程增强及其在药物成瘾中的作用和机制

摘要

突触可塑性是神经科学近年来进展最快、取得成果最多的研究领域，其主要表现形式长时程增强(long-term potentiation,LTP)和长时程减弱(long-termdepression，LTD)已被公认为是学习记忆活动在细胞分子水平的生物学基础。其中海马的LTP研究最多，诱导方式多样，细胞内机制复杂。行为学实验发现应用NMDA受体拮抗药阻断海马区域的NMDA受体后，大鼠的学习行为能力明显下降，同时海马的LTP不能被成功地诱导产生，表明海马的LTP与学习记忆密切相关。杏仁核作为边缘系统的重要组成部分，主要参与情绪情感有关的学习记忆过程。对杏仁核突触可塑性如LTP及其机制的研究将有助于探讨杏仁核的功能。
　　 杏仁核与成瘾药物的共同奖赏通路腹侧被盖区-伏隔核有着密切的解剖结构联系，行为学实验表明杏仁核参与药物成瘾的过程。药物成瘾的核心特征是强迫性用药：即成瘾者失去了对药物摄取和寻觅的控制。在药物成瘾和戒断期间，与药物心理依赖相关的记忆牢固且持久，特别是在吗啡类药物成瘾者中，对药物引起的特殊记忆很难随时间的延长而减弱，而且这种信息的提取同环境密切相关。药物成瘾被普遍认为是一种病理性的强化型记忆，其中长时程增强(LTP)作为学习记忆过程一种主要的细胞内机制，其在成瘾中的作用倍受关注。滥用药物影响药物成瘾相关脑区如腹侧被盖区、伏隔核和海马的LTP，提示这些变化是用药行为产生的结果，而且通过记忆的形式得到加强。杏仁核参与药物成瘾的发生发展过程，然而杏仁核LTP在药物成瘾中的作用目前尚不清楚。
　　 我们的实验通过在大鼠离体脑片上记录基底外侧杏仁核(basolateralamygdala，BLA)的场电位，比较不同参数的强直刺激在诱导BLA LTP中的作用，并采用受体阻断剂和细胞通路抑制剂探讨BLA LTP的细胞过程。应用条件性位置偏爱建立吗啡成瘾组、成瘾消退组和复吸组动物模型，观察比较不同组之间BLALTP的差异，探讨杏仁核LTP在药物成瘾中的作用及其机制。
　　 大鼠断头后制备脑片，在解剖显微镜下把双极钨刺激电极置于外囊(externalcapsule,EC)，记录微电极的尖端置于杏仁核的基底外侧区。记录电极在脑片表面下约250μm，刺激电极与记录部位之间的距离大约为2 mm。刺激信号由RM6240程控刺激器产生，实验常规刺激的波宽0.1 ms、频率0.1 Hz，场电位通过SWF-2W微电极放大器放大后，应用RM6240系统进行信号的记录、分析和处理。实验中应用不同的参数诱导BLA的LTP，研究不同的刺激方式与LTP诱导之间的关系。通过在灌流液中分别加入NMDA受体阻断剂、PKC和酪氨酸蛋白激酶抑制剂，观察所诱导的LTP的变化，探讨BLA LTP可能的分子机制。
　　 实验中观察到在脑片保持良好活性及记录系统噪音幅度小于0.01 mV的前提下，应用国产的微电极放大器及记录系统即可记录到稳定可靠的杏仁核场电位，幅度约为海马CA1场电位的十分之一；在灌流液中加入AMPA受体拮抗剂CNQX10μM和NMDA受体阻断剂APV100μM后，场电位几乎完全被阻断，表明杏仁核的突触后电位主要由兴奋性的谷氨酸受体介导。应用间隔10 min的两串高频刺激(100 Hz,每串1s)刺激外囊，在基底外侧杏仁核(BLA)可诱导明显的LTP，两串高频刺激后30min增强的场电位的斜率仍然维持在基础值的146.1±6.9％(n=9，p＜0.01)。100Hz的高频刺激是诱导LTP的常用模式，另一种模式θ频率波刺激模拟学习过程锥体细胞典型的放电模式，应用θ频率波刺激更接近生理刺激。每串θ频率波刺激为20个(频率5Hz)短时间高频串脉冲(5个脉冲，频率为100Hz)。同样应用两串的θ频率波刺激诱导BLA LTP，并观察不同的串间隔诱导的BLA LTP的差异。间隔10s的两串θ频率波未能在BLA诱导出LTP；增大串刺激间隔为10min或30min，均可观察到记录的场电位明显增大，增强的场电位持续时间超过30min，串间隔为10min的参数诱导的LTP最明显；但串间隔10min和30min的θ频率波刺激所诱导LTP统计学上没有显著性差异，结果提示神经细胞两个事件的间隔变化可影响突触传递的效率及突触可塑性，从而影响学习记忆的过程，而且可能存在一段最适宜的间隔，间隔太短或太长都将降低学习记忆的效率。EC-BLA的LTP表现为通路特异性，且可被NMDA受体阻断剂APV所阻断。在灌流液中加入蛋白激酶C(PKC)抑制剂chelerythrinechloride，对BLA的基础场电位和配对脉冲比率(paired-pulse ratio，PPR)不产生影响；但在chelerythrine chloride存在的情况下，两串间隔10min的θ频率波刺激未能诱导出LTP；于两串高频刺激10 min之后加入chelerythrine chloride则不能阻断BLA的LTP，结果表明PKC参与BLA LTP的诱导和早期维持。灌流的人工脑脊液中加入酪氨酸蛋白激酶抑制剂genistein也可抑制BLA LTP的诱导，酪氨酸蛋白激酶参与BLA LTP的过程。
　　 应用条件性位置偏爱(CPP)建立吗啡成瘾组动物模型，模型建立后的第二天至第四天(成瘾消退之前)制备脑片，应用两串(间隔10s)的高频刺激诱导BLALTP，比较吗啡成瘾组与对照组LTP的差异。对照组高频刺激后，场电位出现一过性增大，高频刺激30 min后，场电位基本恢复正常，为基础场电位的114.0±6.3％(n=9，P＞0.05)。成瘾组高频刺激后，场电位明显增大，并且这种增强作用持续30min以上，高频刺激后30 min，增强的场电位的斜率仍然维持在基础场电位的154.8±5.3％(n=14，P＜0.01)。为观察PKA是否参与成瘾组基底外侧杏仁核LTP的过程，实验中在灌流液中加入PKA抑制剂PKI-(6-22)-amide Tocris(1μmol/L，n=6)，其对基础的场电位没有影响，PKI-(6-22)-amide Tocris作用15 min后场电位仍为基础值的99.4士3.8％(n=6，P＞0.05)。然而在PKA抑制剂存在的情况下，两串HFS刺激外囊，基底外侧杏仁核诱导的LTP明显减弱。高频刺激后30 min，场电位的斜率为122.2±4.6％(n=6，P＜0.01 vs成瘾组)。
　　 应用CPP建立吗啡消退组动物模型，与高频刺激前基础值相比，消退组两串HFS仍可诱导出LTP,高频刺激30 min后为基础场电位的128.0±9.3％(n=8，P＜0.01)，但与成瘾组相比，消退组杏仁核的LTP减弱(P＜0.01)。应用半剂量吗啡点燃和强迫冰冷水游泳5 min应激点燃两种方式建立CPP吗啡重现组动物模型。实验中观察到重现组两串HFS又可以在BLA诱导出明显的LTP，高频刺激后30min，场电位分别为基础场电位的142.7士8.0％(半剂量吗啡重现组，n=7，P＜0.01)和143.3±6.0％(强迫冰冷水游泳应激重现组5 min，n=5，P＜0.01)，但两种点燃方式间没有差异(P＞0.05)。
　　 实验结果显示串间隔为10min的θ频率波或100 Hz的刺激是诱导BLA LTP的较佳参数。BLALTP为通路特异性和NMDA受体依赖性，细胞内蛋白激酶C和酪氨酸蛋白激酶参与了BLA LTP的诱导和维持。在吗啡成瘾和发展的过程中，杏仁核LTP的变化不同，成瘾组增强，消退组减弱但与对照组相比仍可诱导出LTP，复吸组又增强，提示成瘾药物所致的BLA LTP并不是持久的、简单的单向变化，而是呈双向的变化趋势，基底外侧杏仁核在药物成瘾过程中既有神经元的适应性变化又有突触可塑性变化。杏仁核参与学习记忆的过程，对杏仁核LTP的特点、性质、表现形式和细胞学机制的研究，有助于了解杏仁核的功能及其在学习记忆中的作用。研究杏仁核LTP与学习记忆在药物成瘾形成和复吸中的作用及其可能的机制，可为评价和干预成瘾的发生发展及复吸提供科学依据。另一方面，药物成瘾可为研究神经系统的突触可塑性机制和作用及大脑的学习记忆过程提供一种模型，将有助于阐明学习记忆的脑内机制。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分基底外侧杏仁核长时程增强的诱导及其机制的探讨

1.引 言

2.材料与方法

3.结 果

4.讨论

5.小 结

6 参考文献

第二部分基底外侧杏仁核长时程增强在吗啡成瘾中的作用及其机制

1.引 言

2.材料与方法

3.结 果

4.讨论

5.小 结

6 参考文献

综述 长时程增强及其与成瘾记忆关系的研究进展

致谢