高迁移率族蛋白1在大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及丙酮酸乙酯的疗效

摘要

再灌注治疗虽然使缺血部位心肌血供得到恢复，但也可导致再灌注损伤。心肌缺血-再灌注损伤(IRI)的存在限制了再灌注治疗效果。炎症反应、氧化应激、钙超载均为心肌IRI的重要机制，但其始发因素及信号转导机制尚未彻底阐明。为此，深入探讨心肌IRI的分子调控机制及有效防治对策必将具有重要的临床及理论价值。本研究利用大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，着重探讨心肌缺血-再灌注后高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达及其与心肌IRI的关系，同时观察丙酮酸乙酯干预对心肌IRI的作用及分子机制，研究主要由四部分组成：①心肌缺血-再灌注后高迁移率族蛋白1的表达及其作用，②丙酮酸乙酯干预心肌缺血-再灌注损伤的剂量及时机，⑧高迁移率族蛋白1介导炎性缺血-再灌注损伤的机制及丙酮酸乙酯的作用，④丙酮酸乙酯对心肌缺血-再灌注后氧自由基及线粒体的影响。
　　 第一部分：心肌缺血再灌注后高迁移率族蛋白1的表达及其作用。
　　 目的：探讨高迁移率族蛋白1(high mobility group box1，HMGB1)在心肌缺血-再灌注后的时空表达特点；观察外源性HMGB1对心肌缺血再灌注损伤的影响及其可能机制。
　　 方法：第Ⅰ部分：清洁级健康雄性SD大鼠分为5组，每组6只，分别于心肌缺血前、缺血30分钟、再灌注30分钟、再灌注24小时、再灌注48小时处死大鼠，留取标本检测HMGB1的表达。第Ⅱ部分：清洁级健康雄性SD大鼠分为4组，每组6只，均给予缺血30分钟，再灌注48小时：对照组(Control)，HMGB1-1μg/kg组(HMGB1-1μg)，HMGB1-10μg/kg组(HMGB1-10μg)，HMGB1-100μg/kg组(HMGB1-100μg)，后3组在缺血再灌注后注射相应剂量rhHMGB1。采用有创血流动力学检测大鼠左心功能变化，TTC染色计算心肌梗死面积，免疫组化、Real-time PCR、Western Blot检测HMGB1及其受体RAGE、TLR-2、TLR-4的表达。
　　 结果：第Ⅰ部分：在正常心肌组织中，HMGB1蛋白定位于心肌细胞核内；心肌缺血再灌注后，HMGB1阳性表达的细胞不仅位于心肌细胞核内，而且大量表达于梗死区域内的炎性细胞；HMGB1在大鼠心肌缺血30分钟后显著增高，并持续至再灌注48小时。第Ⅱ部分：与Control组相比，HMGB1-1μg组、HMGB1-10μg组心肌梗死面积、±dp/dt max、RAGE、TLR-2、TLR-4无显著差界(P＞0.05)；但与Control组相比，HMGB1-100μg组心肌梗死面积显著增大(56.4±5.1％vs.44.6±3.7％，P＜0.05)，±dp/dt max显著恶化(2199±185 mmHg/s vs.2890±217mmHg/s；1536±122mmHg/s vs.1979±190 mmHg/s；p＜0.05)；HMGB1、TNF-d及IL-6水平显著增高，与Control组相比，HMGB1-100μg组RAGE、TLR-2、TLR-4水平明显增高，其中以RAGE升高幅度最为明显。
　　 结论：心肌缺血再灌注后心肌及炎症细胞胞核浆HMGB1表达显著增高，外源性HMGB1进一步放大心肌炎症反应、增大梗死面积；HMGB1主要通过RAGE受体介导加重炎症反应及心肌损伤。
　　 第二部分：丙酮酸乙酯干预心肌缺血再灌注损伤的剂量及时机。
　　 目的：观察不同剂量丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate，EP)对缺血-再灌注心肌的保护作用即量效关系研究；在合适的剂量下，探索其有效的治疗窗口即时效关系研究。
　　 方法：量效关系部分：清洁级健康雄性SD大鼠分为6组，每组6只，给予缺血30分钟，再灌注48小时，具体分组如下：Control组、10mg/kg组、20mg/kg组、40mg/kg组、80mg/kg组、160mg/kg组。Control组给予乳酸林格斯液静脉注射，其余各组均于缺血前2分钟给予相应剂量的EP静脉注射。时效关系部分：清洁级健康雄性SD大鼠分为4个组，每组6只，给予缺血30分钟，再灌注48小时，具体分组如下：Control组(缺血前2分钟给予乳酸林格斯液注射)，缺血前2分钟给药组(Is)，再灌注前2分钟给药组(R)，再灌注后30分钟给药组(R30)。除Control组外，其余各组均给予EP(40mg/kg)于相应的时间点静脉注射。采用有创血流动力学检测大鼠左心功能变化，TTC染色计算心肌梗死面积。
　　 结果：在量效关系部分，与Control组相比，心梗面积在20mg/kg组就显著减小(36.1±1.6％vs.45.9±4.2％，P＜0.05)，心功能显著改善，当剂量增加到40mg/kg时，心梗面积进一步减小(28.7±1.5％vs.45.9±4.2％，P＜0.05)，心功能进一步改善，当给药剂量进一步增加到80mg/kg、160mg/kg时，心梗面积未见进一步减小。在时效关系部分，与Control组相比，Is组、R组均可显著减少心肌梗死面积(29.0±2.5％，35.3±2.8 vs.46.4±3.8％，P＜0.05)，改善心功能；R30组心梗面积有减小趋势，但无统计学差异(42.7±3.4％vs.46.4±3.8％，P＞0.05)。
　　 结论：40mg/kg的EP是治疗大鼠心肌缺血-再灌注损伤的最佳剂量；缺血前预先应用EP的疗效优于再灌注即刻给药，当给药时问延迟到再灌注后30分钟则EP的心肌保护作用消失；缺血前2分钟至再灌注前2分钟是EP保护心肌缺血-再灌注损伤的最佳时间窗。
　　 第三部分：HMGB1介导炎性缺血-再灌注损伤的机制及EP的作用。
　　 目的：观察丙酮酸乙酯(EP)干预对炎症因子表达及炎症性心肌缺血-再灌注损伤的影响；研究EP干预对心肌缺血-再灌注后炎症因子表达变化的调控机制。
　　 方法：清洁级健康雄性SD大鼠分为4组，每组12只，均给予缺血30分钟，再灌注48小时：1.假手术组(Sham)，只穿线不结扎；2.对照组(Control)，于再灌注前给予PBS0.5ml+RLS0.5ml静脉注射；3.EP治疗组(EP)，再灌注前2分钟给予静脉注射EP(40mg/kg)；4.EP+HMGB1组(EP+HMGB1)：缺血再灌注前2分钟静脉注射EP(40mg/kg)+重组HMGB1(100μg/kg)。采用有创血流动力学检测大鼠左心功能变化，TTC染色计算心肌梗死面积，ELISA法检测血清HMGB1、TNF-d、IL-6，Western Blot检测心肌磷酸化P38的表达。
　　 结果：与Sham组相比，Control组心肌梗死面积显著增加，心功能显著恶化，血清HMGB1、TNF-α、IL-6表达显著增高，磷酸化P38水平显著增高(P＜0.05)；与Control组相比，给予EP治疗后心肌梗死面积显著下降(35.0±3.1％vs.45.7±3.5％，P＜0.05)，心功能明显改善，HMGB1、TNF-d、IL-6及磷酸化P38水平显著降低，而当HMGB1(100μg/kg)与EP同时给药时，EP的心肌保护效益完全消失。
　　 结论：心肌缺血再灌注前给予适时适量EP能抑制炎症因子HMGB1、TNF-α、IL-6的表达，减少炎性心肌缺血-再灌注损伤；同时给予外源性HMGB1则可完全消除EP的心肌保护作用；EP通过影响HMGB1与受体结合后的信号转导通路关键蛋白p38的磷酸化、阻断或降低HMGB1介导的促炎反应及炎性心肌缺血-再灌注损伤。
　　 第四部分：丙酮酸乙酯对心肌缺血再灌注后氧自由基及线粒体的影响。
　　 目的：探讨丙酮酸乙酯(EP)干预缺血再灌注损伤是否可影响氧自由基的代谢；观察EP干预缺血再灌注损伤是否影响线粒体结构与功能。
　　 方法：清洁级健康雄性SD大鼠分为4个组，每组6只，给予缺血30分钟，再灌注3小时：Sham组(冠脉只穿线不结扎)；Control组(再灌注前2分钟给予RLS静脉注射)；EP治疗组(EP组，再灌注前2分钟给予EP40mg/kg静脉注射)。EP+苍术苷组(EP+Atr组，EP40mg/kg加苍术苷5mg/kg静脉注射)。检测大鼠左心功能变化，心肌梗死面积，心肌MDA、MPO、SOD水平，电镜检测心肌超微结构变化。
　　 结果：与Sham组相比，Control组心肌MDA(6.3±0.7 nmol/mg vs.1.6±0.3nmol/mg，P＜0.05)、MPO(0.35±0.04 U/g vs.0.95±0.12 U/g，P＜0.05)显著升高，SOD显著下降(65±10 U/mg vs.315±46 U/mg，P＜0.05)，线粒体受损明显；与Control组相比，EP治疗组显著减小心肌梗死面积(44.5±4.5％vs.33.7±4.1％，P＜0.05)，抑制MDA(3.2±0.5 nmol/mg vs.control，P＜0.05)、MPO(0.67±0.06U/g vs.control，P＜0.05)增高，提升SOD水平(189±25 U/mg vs.control，P＜0.05)，减轻心肌线粒体损伤；当苍术苷与EP同时给药时，EP的心肌保护效益完全消失。
　　 结论：心肌缺血再灌注前予EP干预可抑制自由基生成、增加对其的清除能力；心肌缺血再灌注前予EP干预可抑制mPTP过度开放、减轻线粒体损伤；心肌缺血再灌注前予EP干预可减少再灌损伤及心梗面积、改善心功能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

第一部分 心肌缺血再灌注后高迁移率族蛋白1的表达及其作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 丙酮酸乙酯干预心肌缺血再灌注损伤的剂量及时机

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 高迁移率族蛋白1介导炎性缺血-再灌注损伤的机制及丙酮酸乙酯的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第四部分 丙酮酸乙酯对心肌缺血再灌注后氧自由基及线粒体的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

致谢

综述：高迁移率族蛋白-1与缺血再灌注损伤