热休克蛋白70与NY-ESO-1多肽复合物的制备以及抗肿瘤效应的体外研究

摘要

【目的】
　　 将原核表达纯化获得的人热休克蛋白70（heat shock protein70, HSP70）与肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1多肽体外连接制备HSP70-NY-ESO-1多肽复合物，检测HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载的树突状细胞（dendritic cells, DC）对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞的体外杀伤效率，探讨增强肿瘤免疫治疗的有效策略。
　　 【方法】
　　 1．人HSP70的原核表达、鉴定及纯化：RT-PCR技术获得人HSP70全长cDNA，将PCR产物克隆到原核表达载体PET-30a质粒上，酶切与DNA测序鉴定后，将PET-30a-HSP70重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)，IPTG诱导蛋白表达，表达产物行SDS-PAGE和Western-blot鉴定，His-tag层析柱纯化HSP70蛋白。
　　 2．人脐带血树突状细胞的培养及鉴定：联合应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(recombination human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(recombination human interleukin-4, rhIL-4)培养人脐带血单个核细胞来源的DC，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)诱导其成熟。通过倒置显微镜、光学显微镜及透射电镜观察DC形态，流式细胞术鉴定DC表型，混合淋巴细胞反应鉴定DC功能。
　　 3．HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载DC的体外杀伤实验：HSP70与NY-ESO-1多肽体外连接，获得HSP70-NY-ESO-1多肽复合物。分别用HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载的DC、NY-ESO-1多肽负载的DC、HSP70负载的DC以及未经负载的DC刺激淋巴细胞，并以未经DC刺激的淋巴细胞作为对照组，共5组淋巴细胞，乳酸脱氢酶(lactic dehydroge-nase, LDH)释放法检测淋巴细胞对NY-ESO-1阳性脑胶质瘤细胞的体外杀伤效率。
　　 【结果】
　　 1．人HSP70的原核表达、鉴定及纯化：RT-PCR扩增出大小约2000bp的目的片段，经酶切和DNA测序证实，HSP70基因成功地克隆到原核表达载体PET-30a质粒上；转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，SDS-PAGE显示，在分子量为约72KD处有表达量明显增多的蛋白条带，Western-blot证实其为目的条带，纯化后蛋白纯度达95％。
　　 2．人脐带血树突状细胞的培养及鉴定：培养第8d的成熟DC(mature DC, mDC)形态学观察：细胞体积大，形态不规则，有典型的树枝状突起；流式细胞术鉴定：mDC表达HLA-DR（80.65％）、CD86（76.59％）、CD83（74.81％），较不成熟DC(immature DC, imDC)表达明显上升（HLA-DR、CD86与CD83分别为25.20％、17.58％、1.50％）；混合淋巴细胞反应证实：mDC体外激发混合淋巴细胞反应能力较强，imDC则较弱。
　　 3．HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载DC的体外杀伤实验：HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载DC组的淋巴细胞对NY-ESO-1阳性脑胶质瘤细胞的杀伤活性明显高于其他四组，差别有显著性意义（P<0.001）；NY-ESO-1多肽负载的DC组淋巴细胞杀伤活性高于HSP70负载的DC组、未经负载的DC组以及对照组，差别有显著性意义（P<0.001）；HSP70负载的DC组、未经负载的DC组与对照组相比杀伤率无显著差别（P>0.05）。
　　 【结论】
　　 1．成功构建HSP70的原核表达载体，并高效表达HSP70蛋白，纯化可获得大量高纯度的HSP70蛋白。
　　 2．联合应用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α可以从人脐带血单个核细胞中培养出足够数量的成熟DC。
　　 3．HSP70-NY-ESO-1抗原肽复合物负载DC能在体外有效激活和扩增肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)，HSP70能够协同NY-ESO-1抗原肽对NY-ESO-1阳性脑胶质瘤细胞的杀伤，增强NY-ESO-1抗原肽的抗肿瘤免疫作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩略名称对照表

声明

前 言

第一部分 人HSP70的原核表达、鉴定及纯化

第二部分 人脐带血树突状细胞的培养及鉴定

第三部分 HSP70-NY-ESO-1多肽复合物负载DC的体外杀伤实验

结 论

参考文献

致 谢

热休克蛋白70抗肿瘤免疫的研究进展