锁核酸电化学传感器在急性早幼粒细胞白血病实际样品检测中的影响因素分析及应用研究

摘要

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中较常见的类型，其最为常见的染色体易位为t(15：17)(q22; q21)，形成PML/RARα融合基因，在APL早期诊断和预后监测中具有重要意义。电化学生物传感器是基于生物识别的高度专一性发展起来的一种分析技术，具有选择性好、灵敏度高、分析快速、成本低的特点，在环境监测、临床诊断、农残分析、食品药品工业等领域具有广泛的应用前景。
　　 本文第一部分针对APL中PML/RARα融合基因的碱基序列，设计了锁核酸(LNA)修饰的捕获探针及信号探针，与电化学酶联免疫分析技术相结合构建新型的“三明治”电化学传感模式，用于PBS缓冲液与血清中人工合成PML/RARα融合基因的检测，对传感器的抗干扰能力进行考察。结果表明，该传感器在两种背景中均显示出较好的特异性，能很好地区分互补序列、单碱基及多碱基错配序列；PBS缓冲液中杂交电流值与目标链浓度在1.0×10-12～2.0×10-11mol/L范围内呈较好的线性关系，检出限为6.9×10-14 mol/L；人血清中PML/RARα融合基因的检测信号与目标链浓度在1.0×10-11～1.0×10-8 mol/L呈非线性对数关系，检出限低至1.0×10-12mol/L（>3SD），说明传感器具一定的抗干扰能力。
　　 第二部分主要考察了传感器在双链DNA与长链DNA检测中的应用。实验研究表明变性dsDNA链间的复性是影响dsDNA检测的关键因素。实验中通过加入短片段的PML、RARα序列，可抑制变性dsDNA链间的复性，在不使用任何变性剂或解旋酶的情况下实现了传感器直接用于dsDNA的检测；此外，对于长链的研究结果表明，当与探针结合序列位于链的不同部位（3’端、中间及5’端）时，其电化学检测信号不同。长链3’端的非互补序列会阻碍目标链与探针的杂交反应，降低杂交效率及检测灵敏度。此结果为样品制备提供了有力的理论依据。
　　 最后，利用之前建立好的方法，开展APL实际样品的初步实验研究。运用PCR技术，得到PML/RARα融合基因的PCR扩增产物，并对其进行电化学检测。结果表明，PCR产物经凝胶电泳检测大小为190bp左右，测序结果确定含有与探针互补序列。在100μL杂交体系中，该传感器可实现PCR样品的特异性检测，为实际样品的进一步检测研究提供了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写字表

声明

前 言

第一部分 锁核酸传感器检测PBS缓冲液及血清中人工合成PML/RARα基因的实验研究

第二部分 锁核酸传感器检测不同类型的人工合成PML/RARα基因的实验研究

第三部分 锁核酸传感器检测急性早幼粒细胞白血病实际样品的初步实验研究

参考文献

结 论

致 谢

攻读硕士学位期间发表的论文

锁核酸在DNA生物传感器中的应用