针对LOX-1的吡咯-咪唑聚酰胺药物支架对大鼠腹主动脉支架内再狭窄的影响

摘要

冠脉药物洗脱支架(DES)部分解决了支架植入后的再狭窄问题，但也凸显了局部内皮化延迟及晚期血栓形成的风险。支架内再狭窄(ISR)具有高度局部化的特性，从而使局部的基因沉默治疗成为可能。对再狭窄相关致病基因的特异性沉默可以在解决再狭窄问题的同时避免局部内皮化的延迟。吡咯-咪唑聚酰胺(PIP)是一种能使特定基因沉默的化合物，与传统基因沉默技术相比，它能够不借助任何特殊载体进入细胞核，同时，由于其分子量小、结构稳定、对核酸酶耐受、细胞摄取率及生物利用度高、脂溶性强，因此更适合作为靶点基因沉默药物用于支架系统。引起再狭窄的最主要病理过程是血管平滑肌细胞(VSMCs)在血管损伤后的增殖及由中膜向外膜迁移，从而导致的新生内膜(NIH)形成。凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体(LOX-1)的激活及其与氧化应激反应之间的正反馈在VSMCs的增殖和迁移及NIH生成的过程中发挥着重要的作用。因此，本研究建立离体及在体模型，着重探讨针对LOX-1基因启动子的PIP能否特异性的抑制LOX-1基因的表达，从而阻断LOX-1与氧化应激之间的正反馈，达到抑制VSMCs增殖、迁移和抑制支架内再狭窄的目的，为开发新一代的药物支架提供理论依据。研究主要由2部分组成：①合成能特异性沉默LOX-1基因的PIP化合物，并观察其对ox-LDL介导的VSMCs的增殖和迁移的影响；②制备能特异性沉默LOX-1的PIP药物支架并将其植入大鼠腹主动脉内，观察其对损伤血管局部支架内再狭窄及再内皮化的影响。
　　 一、针对LOX-1的PIP对ox-LDL介导的VSMC增殖和迁移的影响
　　 目的：合成能特异性沉默LOX-1基因的PIP，观察PIP对ox-LDL介导的VSMCs增殖和迁移的影响。
　　 方法：构建大鼠LOX-1基因启动子的报告基因质粒并将其转染入HEK293细胞，确定LOX-1基因AP-1增强子位点，根据吡咯-咪唑与DNA小沟的碱基配对原则确定能特异性沉默LOX-1基因的PIP结构式并合成PIP化合物。体外培养大鼠胸主动脉VSMCs并行α-肌动蛋白(α-SMA)特异性免疫细胞化学染色鉴定。细胞实验共分为4组：Control组，Control+ox-LDL(10ug/ml)组，Control+ox-LDL+PIP (10-6mmol/L)组，Control+ox-LDL组+mismatch PIP (10-6mmol/L)组。通过Westblot法测定各组细胞LOX-1表达的情况，通过细胞计数法、噻唑蓝比色(MTT)法测定各组细胞增殖的情况，通过Transwell细胞迁移实验观察各组细胞的迁移情况。
　　 结果：使用胶原酶消化法培养原代VSMCs，细胞呈典型的“峰-谷”状生长，经α-SMA特异性免疫细胞化学染色后，VMSCs胞浆呈阳性反应。Ox-LDL(10μg/ml)能够诱导VSMCs的细胞计数增多，MTT代谢率增高及细胞迁移增多(P<0.01)。PIP (10-6mmol/L)能够明显降低ox-LDL刺激引起的VSMCs LOX-1表达增高(P<0.01)，同时，PIP (10-6mmol/L)能够显著抑制VSMCs的细胞计数增多、MTT代谢率增高及细胞迁移增多(P<0.01)。而mismatch PIP则无此效果。
　　 结论：针对LOX-1基因AP-1启动子位点的PIP能够特异性的沉默LOX-1基因，并明显减低ox-LDL刺激引起的VSMCs增殖和迁移。能特异性沉默LOX-1基因的PIP应用于药物支架系统预防支架植入后再狭窄的作用值得进一步探讨。
　　 二、化学基因沉默LOX-1药物支架对大鼠腹主动脉支架内再狭窄及再内皮化的影响
　　 目的：制备能沉默LOX-1基因的PIP药物支架，并将其植入大鼠腹主动脉内，观察其对损伤血管局部支架内再狭窄及再内皮化的影响，并探讨相应机制。
　　 方法：按照1.0μg/mm2的载药量构建2.0×9.0mm PIP药物支架。使用高效液相色谱法(HPLC)测定支架的体内外药物释放动力学。建立大鼠腹主动脉内植入药物支架的动物模型，实验共分为4组：假手术组(n=10)，裸支架组(n=10)，PIP药物支架组(n=10)，mismatch PIP药物支架组(n=10)。每组各3只动物于支架植入14天后处死，留取少量标本行HPLC检测后，将含支架的血管行扫描电镜检查观察各组的支架表面内皮化情况。另外每组各6只动物与支架植入28天后处死，留取少量标本行HPLC检测后，将标本分为3部分，一部分-80°C保存，使用Real-time PCR及Westblot法检测各组的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亚单位、NADPH氧化酶p47phox亚单位的mRNA及蛋白表达情况，一部分组织风干后匀浆，使用硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)法测定各组的丙二醛(MDA)水平。最后一部分部分组织包埋入甲基丙烯酸甲酯中，切取5μm的切片，然后H-E染色后于显微镜下观察并计算新生内膜面积、新生内膜厚度、损伤指数及炎症指数。
　　 结果：PIP药物支架在24h内释放超过90％，能够成功建立大鼠腹主动脉植入药物支架的动物模型。支架植入14d后，局部血管组织中有少量PIP药物留存，扫描电镜显示，裸支架、PIP药物支架、mismatch PIP药物支架表面均具有较高的内皮化程度。支架植入28d后，局部血管组织中仍有微量PIP药物留存；与对照组相比，裸支架组损伤血管局部的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亚单位、NADPH氧化酶p47phox亚单位的mRNA及蛋白表达均明显升高 (P<0.01)，MDA水平明显升高(P<0.01)。PIP药物支架能够降低损伤血管局部的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亚单位、NADPH氧化酶p22phox亚单位的mRNA、蛋白表达及MDA水平(P<0.01)。与裸支架组相比，PIP组支架内新生内膜面积明显降低(P<0.05)，再狭窄程度明显降低(P<0.05)；而mismatch PIP药物支架的上述指标与裸支架相比均无明显差异(P>0.05)。此外，裸支架、PIP药物支架、mismatch PIP药物支架均具有相似的损伤指数及较低的炎症评分。
　　 结论：以DMSO为溶剂的PIP药物支架不具备良好的控释效果，但PIP药物在支架植入28天后在局部血管组织中仍有微量的留存。针对LOX-1的PIP药物支架能够显著降低损伤血管局部的LOX-1、NADPH氧化酶p22phox亚单位、NADPH氧化酶p47phox亚单位的表达水平并显著降低氧化应激水平，从而能显著抑制支架内再狭窄，而不影响支架表面的再内皮化。针对LOX-1的PIP药物支架有望成为新一代的药物洗脱支架(DES)而应用于临床。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分针对LOX-1的PIP对ox-LDL介导的VSMC增殖和迁移的影响

第二部分化学基因沉默LOX-1药物支架对大鼠腹主动脉支架内再狭窄及再内皮化的影响

全文总结

参考文献

博士期间发表的第一作者论文

致谢

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