免疫沉淀筛选与双剪接型2.2KbHBV剪接变异体特异性蛋白HBDSP相互作用的肝细胞蛋白

摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是一种部分双链环状嗜肝DNA病毒，在医学和公共卫生上具有重要的意义。从世界范围来看，大约有350000000的人感染乙肝病毒，其中亚洲地区占了75％。HBV是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要致病原因，每年导致1000000人死亡。
　　HBV基因组剪接变异体(spliced variants of hepatitis B virus genomes)是由3.5Kb前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)经剪接后逆转录而成的一类亚基因组DNA。其中长度为2.2 kb的HBV剪接变异体占了80%以上，其剪接类型分为单剪接型和双剪接型，对2.2KbHBV剪接变异体的功能研究显示，此类变异体可能导致肝细胞凋亡并与HBV的持续性感染密切相关，但其确切致病机制迄今未明。本研究旨在利用免疫沉淀技术探索能够与双剪接型2.2Kb剪接变异体编码的剪接特异性新蛋白（Hepatitis B Doubly Spliced Protein,HBDSP）相互作用的肝细胞蛋白，以此深入了解其致病性。
　　本课题第一部分，运用免疫沉淀（Immunoprecipitation）及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定（MALDI-TOF-MS）的方法获得了四个与HBDSP相互作用的肝细胞蛋白，分别为：通用转录因子Ⅱ,i(General transcription factorⅡ Ⅰ, GTF2Ⅰ或TFⅡ-Ⅰ)、葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein, GRP78)、热休克蛋白70(Heat shock protein70kDa, HSP70)和钾离子通道(Potassium voltage-gated channel, KVβ.2)。本课题第二部分，首先通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验来作验证，结果表明在肝细胞中HBDSP与TFII-I蛋白存在相互作用，而HBDSP与GRP78和KVβ.2没有相互作用。进一步通过GST pull-down实验证实HBDSP与TFII-I蛋白在体外具有相互作用。TFⅡ-Ⅰ蛋白是一个多功能转录因子，不仅能够促进染色质重塑，同时在细胞有丝分裂周期中具有重要作用。HBDSP与TFⅡ-Ⅰ的相互作用，可能影响肝癌细胞的分裂和增殖。本研究为深入探讨HBDSP的致病性奠定基础。

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前言

第一部分免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）筛选与HBDSP相互作用的肝细胞蛋白

材料和方法

1 材料

2 方法

结果

1.1 HBDSP重组穿梭质粒的酶切鉴定

1.3 腺病毒的生成的观察

1.2 重组腺病毒质粒的构建和鉴定

1.4 腺病毒滴度的测定

1.5 腺病毒感染效率的测定

1.6 目的蛋白 HBDSP-Flag 的表达检测

1.7 免疫沉淀获得能与HBDSP蛋白相互作用的蛋白

1.8 蛋白质样品的质谱分析（Mass Spectrometry）

小结

第二部分HBDSP与肝细胞蛋白在体内外相互作用的验证

材料和方法

1 材料

2 方法

结果

1. 以TFII-I、GRP78和 KVβ.2抗体沉淀HBDSP 验证相互作用

2. 以FLAG标签抗体沉淀肝细胞内源性TFII-I蛋白验证TFII-I与HBDSP的相

3. 重组载体的酶切鉴定

4. GST 蛋白和 GST-HBDSP 融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达和纯化

5．GST pull-dow 实验

小结

讨论

结论

参考文献

附录一 英文缩略词表

附录二 试剂配方

附录三 主要仪器设备

致谢

综述

参考文献