Toll样受体在载脂蛋白E敲除小鼠狼疮样自身免疫反应介导动脉粥样硬化机制中的系列研究

摘要

本文主要从以下几部分展开论述：
　　第一部分
　　背景与目的：
　　探讨ApoE-/-小鼠是否存在狼疮样自身免疫反应，并初步探讨其与动脉粥样硬化的可能相关性以及观察TLR在ApoE-/-小鼠脾组织中的表达特点。
　　方法：
　　本研究包括C57BL/6、Fas基因敲除（Fas-/-）以及载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）三种小鼠，后两者皆以C57BL/6为背景。Fas-/-小鼠是一种狼疮小鼠，ApoE-/-小鼠则是一种AS小鼠。ApoE-/-小鼠是实验组，而B6与Fas-/-小鼠分别为阴性与阳性对照组。每组小鼠雌雄各12只，共包括72只小鼠。ApoE-/-、B6小鼠的月龄为2个月。Fas-/-小鼠（狼疮小鼠）月龄为8个月。普通环境下，为了诱发AS,所有小鼠高脂饮食（胆固醇0.25％，脂肪15%）4个月。处死后，ELISA方法检测各组小鼠血清IgG、ANA、抗-dsDNA抗体水平并比较，以明确ApoE-/-小鼠是否存在狼疮样的自身免疫，检测并比较组间脾的重量、肾小球面积以及肾小球内IgG（免疫荧光检测）和C3与巨噬细胞（免疫组化检测）的表达以明确自身免疫复合物的沉积以及上述器官的损害，也检测了血清自身免疫相关因子IL6的水平；观察各组小鼠主动脉AS损害程度，以及斑块内IgG、C3、巨噬细胞与TLR4表达水平，并对主动脉斑块覆盖率以及自身抗体水平进行Pearson相关分析，以明确ApoE-/-小鼠AS与自身免疫反应的相关性；检测比较各组小鼠脾组织TLRs通路分子以及凋亡相关分子Bax的表达水平，评价TLRs在自身免疫反应中的可能作用。
　　结果：
　　1.ApoE-/-组小鼠血清IgG、ANA、抗-dsDNA抗体以及IL6水平、脾的重量、肾小球面积、肾小球内IgG和C3的表达，与B6组比较显著增加（P均＜0.05），与Fas-/-组比较无显著差异（除IL6外）；与雄性ApoE-/-小鼠相比较，雌性脾的重量、肾小球面积、外周血IgG、ANA、抗-dsDNA抗体以及IL6水平、肾小球内C3的表达水平显著增加（P均＜0.05）；肾小球内巨噬细胞的表达仅见于ApoE-/-小鼠，而且无显著性别差异，但肾小管巨噬细胞的表达仅见于雄性ApoE-/-小鼠；
　　2.ApoE-/-小鼠表现出了AS，而B6与Fas-/-小鼠皆未发生AS,亚组分析显示雌性ApoE-/-小鼠AS程度重于雄性（P＜0.05）；AS斑块内，IgG、C3、巨噬细胞以及TLR4表达皆阳性，雌性比雄性表达较多的IgG、C3与较少的巨噬细胞（P均＜0.01）；
　　3.ApoE-/-小鼠AS程度与血清ANA、抗-dsDNA抗体水平正相关（P均＜0.05）；4.脾组织蛋白TLRs分析显示，ApoE-/-与Fas-/-小鼠脾组织TLR4的表达水平显著低于B6小鼠（P均＜0.01），而且ApoE-/-小鼠TLR4的表达水平也显著低于Fas-/-小鼠（P均＜0.01），雌性ApoE-/-小鼠TLR4的表达水平显著低于雄性（P＜0.01）；ApoE-/-与Fas-/-小鼠TLR7的表达水平显著高于B6小鼠（P均＜0.01），而且ApoE-/-小鼠TLR7的表达水平也显著高于Fas-/-小鼠（P＜0.01）;ApoE-/-小鼠TLR2与9的表达水平与B6小鼠无显著差异，但TLR9的表达水平显著低于Fas-/-小鼠（P＜0.01）。
　　5.ApoE-/-小鼠脾组织TLRs通路分子表达水平分析：ApoE-/-小鼠MyD88、NF-κB、pp38以及IRF3的表达水平皆显著低于B6小鼠（P皆＜0.01），其中MyD88、IRF3以及pp38的水平也显著低于Fas-/-小鼠（P皆＜0.01），而NF-κB的表达水平与Fas-/-小鼠的差异不显著。亚组分析显示：雌性ApoE-/-小鼠MyD88、NF-κB以及IRF3的表达水平皆显著低于雄性（P皆＜0.01）。
　　6.ApoE-/-小鼠脾组织Bax的表达水平小于B6组（P＜0.01），而与Fas-/-组无显著差异；亚组分析显示雌性ApoE-/-小鼠Bax表达水平显著低于雄性ApoE-/-小鼠（P＜0.01），也显著低于雌性Fas-/-小鼠（P＜0.01）。
　　结论：
　　1.ApoE-/-小鼠表现出了狼疮样的自身免疫反应，此自身免疫反应与AS有相关性；
　　2.ApoE-/-小鼠脾组织低表达的TLR4信号转导通路可能与自身抗体水平的升高及狼疮样自身免疫有关。此发现对于探索ApoE-/-小鼠的自身免疫机制有重要意义；
　　3.ApoE-/-小鼠脾组织TLR4信号通路分子表达、狼疮样自身免疫以及AS皆存在性别差异。
　　第二部分
　　背景与目的：
　　一、通过TLR4配体LPS的腹腔注射而引发TLR4下游信号分子水平表达变化，观察自身免疫反应、AS以及脾组织Bax表达水平受到的影响；二、通过在应用TLR4配体的同时加用TLR4信号通路的抑制剂TAK-242，观察脾组织TLR4下游信号分子水平表达变化，观察自身免疫反应、AS以及脾组织Bax表达水平受到的影响。进一步探讨TLR4与自身免疫反应和AS之间的关系，并试图从其信号转导通路分子水平上探讨其致病机制。
　　方法：
　　一、包括48只8周龄ApoE-/-小鼠（雌雄各半），雌雄小鼠皆分为盐水（NS）组（12只）与LPS组（12只），共计4组。LPS组的小鼠腹腔注射LPS盐水溶液（2.5mg/kg，250μg/ml），每周两次；NS组的小鼠则相应的注射等容积的NS。共注射20周（W）的LPS或NS。在实验的第0、2、4、8、12、16以及20W断尾取血获取血清，检测每只小鼠血清IgG、抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）以及抗双链DNA(anti-double strain DNA，抗-dsDNA）抗体的水平，并比较组间差异,以了解TLR4配体对自身抗体水平的影响以及自身抗体水平的动态变化。20W后处死动物,检测每只小鼠免疫器官脾的重量、观察脾内TLR4信号分子以及Bax表达水平在注射LPS后的变化，了解TLR4信号通路与凋亡相关分子Bax的关系，以及TLR4配体对它们表达水平的影响。采用HE染色、免疫组化及免疫荧光方法检测肾小球面积、肾小球内C3、IgG以及肾内巨噬细胞的表达水平，并组间比较，以了解TLR4配体对免疫复合物沉积以及其对组织器官的损伤作用。观察脾内TLR4信号分子以及Bax表达水平在注射LPS后的变化，了解TLR4信号通路与Bax的关系，以及TLR4配体对它们表达水平的影响，并观察LPS对AS的影响；二、包括18只雄性ApoE-/-小鼠，随机分为三组：DMSO组，DMSO＋LPS组以及DMSO＋LPS＋TAK-242组，实验在第一部分进行4周后开始，同样检测上述自身抗体、免疫复合物沉积、AS以及脾组织TLR4衔接分子和Bax等指标。
　　结果：
　　一、
　　1.注射TLR4配体LPS2W后，雄性ApoE-/-小鼠血清IgG、ANA以及抗-dsDNA抗体水平较NS组持续升高(P皆＜0.01)；而雌性上述指标第4-12W周显著升高(P皆＜0.05)，以后呈现下降趋势，至第20W显著低于NS组（P＜0.01）；
　　2.注射TLR4配体20W后，雄性ApoE-/-小鼠脾、肾重量、肾小球面积、肾小球C3与IgG表达较NS组显著增加（P皆＜0.05或0.01），而雌性增加不显著(除C3外）；
　　3.注射TLR4配体20W后脾组织蛋白检测显示：雄性ApoE-/-小鼠TLR4、MyD88、NF-κB、IRF3、pp38以及Bax表达水平较NS组显著下降（P皆＜0.01），而雌性ApoE-/-小鼠显著增加（P皆＜0.01）；
　　4.注射TLR4配体20W后ApoE-/-小鼠AS程度加重。
　　二、
　　1.实验的第2W开始DMSO＋LPS＋TAK-242组ApoE-/-小鼠血清IgG、ANA以及抗-dsDNA抗体水平持续显著低于DMSO＋LPS组（P＜0.01），与DMSO组无显著差异；
　　2.实验第16 W后，DMSO＋LPS＋TAK-242组ApoE-/-小鼠脾、肾重量、肾小球面积、肾小球C3与IgG表达较DMSO＋LPS组显著降低（P皆＜0.05或0.01），而与DMSO组无显著变化；
　　3.实验第16 W后，脾组织蛋白检测显示：DMSO＋LPS＋TAK-242组ApoE-/-小鼠TLR4、MyD88、NF-κB、IRF3、pp38以及Bax表达水平高于DMSO＋LPS组（P皆＜0.01），而与DMSO组无显著变化；
　　4.DMSO＋LPS＋TAK-242组AS程度显著轻于DMSO＋LPS组（P＜0.05），而与DMSO组无显著差异。
　　5.DMSO＋LPS＋TAK-242组AS斑块内TLR4表达水平显著低于DMSO＋LPS组（P＜0.05），而与DMSO组无显著差异。
　　结论：
　　1.TLR4配体（LPS）可以加重ApoE-/-小鼠的自身免疫与AS；
　　2.TLR4抑制剂可以显著减弱LPS对雄性ApoE-/-小鼠自身免疫与AS的影响；
　　3.TLR4通路可能通过调节Bax水平而影响ApoE-/-小鼠脾组织细胞的凋亡，引发自身抗体水平的变化；
　　4.TLR4可能通过影响ApoE-/-小鼠的自身免疫反应而加重AS。

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中文摘要

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英文缩写词

论文 一载脂蛋白E敲除小鼠的狼疮样自身免疫及其与动脉粥样硬化的相关性研究

前言

1 材料与方法

1.1 研究对象与实验条件

1.2 饮食与饲养条件

1.3 实验器材、设备及试剂

1.4 静脉血的收集与储存

1.5 组织处理

1.6 血清IgG、ANA、抗-dsDNA以及IL6的检测(ELISA方法)

1.7 脾组织蛋白TLRs通路分子以及凋亡调节蛋白Bax检测（Western-blot方法）

1.8 肾小球面积、免疫复合物与巨嗜细胞检测（HE染色、免疫组化与免疫荧光方法）

1.9 主动脉硬化斑块程度的检测（油红O）、IgG、C3、巨噬细胞与TLR4免疫组化

2结果

2.1 ApoE-/-小鼠狼疮样自身免疫反应

2.2 脾组织TLRs以及下游分子的表达

2.3 脾组织Bax的表达

2.4 血脂水平与动脉粥样硬化程度的检测

2.5 AS斑块内C3、IgG、巨噬细胞以及TLR4的表达

2.6 主动脉AS程度与自身抗体水平相关性分析

3讨论

3.1 诱发狼疮发病的因素

3.2自身抗体的产生与自身免疫复合物的形成

3.3 脏器损伤

3.4 脾组织TLRs表达与自身免疫反应的可能关系

3.5 自身免疫反应与AS

3.6 本研究的创新点和局限性

4 结论：

参考文献

中文摘要

英文摘要

英文缩写词

论文二Toll样受体4在载脂蛋白E敲除小鼠自身免疫反应以及动脉粥样硬化中的作用

前言：

1 材料与方法

1.1 研究方法设计线路图

1.2 研究对象与实验室

1.3 TLR4配体与TLR4通路抑制剂的应用

1.4 实验器材设备与试剂

1.5组织的处理

1.6 血清IgG、ANA与抗ds-DNA抗体的检测

1.7脾组织蛋白TLR4通路分子以及Bax的 Western blot检测

1.8 肾小球面积、免疫复合物与巨噬细胞检测（HE染色、免疫组化与免疫荧光方法）

1.9 主动脉硬化斑块程度的检测（油红O）、C3、巨噬细胞与TLR4免疫组化

1.10 统计学分析

2结果

2.1第一部分

2.2 第二部分

3讨论

3.1 TLR4配体持续腹腔注射对脾组织TLR4信号通路以及Bax的影响

3.2 TLR4配体与抗体水平以及器官损害的关系

3.3 TLR4配体对小鼠一般情况的影响

3.4 TLR4配体对雌性ApoE-/-小鼠自身免疫特殊调节作用的可能因素

3.5 TLR4配体LPS对AS的影响

3.6 TLR4配体LPS对动脉斑块内TLR4表达水平的影响

3.7 TLR4、自身免疫反应以及AS的可能关系

3.8 本研究的创新点和限制性

4 结论

参考文献

致谢

综述

参考文献