利拉鲁肽联合骨髓间充质干细胞治疗对STZ诱导的1型糖尿病大鼠糖代谢的影响研究

摘要

目的:
　　1、采用密度梯度离心联合差壁培养法,建立一种较理想的大鼠骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells,BM-MSCs)体外培养扩增体系。
　　2、在体外研究探讨利拉鲁肽(Liraglutide,LIRA)对BM-MSCs定向诱导分化的作用,并比较其与胰升糖素样肽1(Glucagon-likePeptide-1,GLP-1)的诱导效果差异。
　　3、观察利拉鲁肽联合骨髓间充质干细胞(LIRA+BM-MSCs)移植对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病(Type1DiabetesMellitus,T1DM)大鼠胃肠道激素水平和胰岛β及α细胞功能的影响。
　　方法:
　　1、依据骨髓细胞比重的差异性,利用大鼠淋巴细胞分离液初步分离骨髓单个核细胞,再根据其差壁生长特性,通过定期换液的方式对其中单个核细胞进一步纯化,最后以流式细胞仪测定分离后P3代细胞间充质干细胞表面标志CD29、CD90、CD73和CD105,造血干细胞表面标志CD34以及白细胞表面标志CD45,并在特定培养基下观察其向成骨以及成脂细胞分化的能力。
　　2、在高糖、低糖加尼克酰胺的两阶段诱导基础上,以GLP-1为对照,荧光定量PCR检测巢蛋白(Nestin)、胰十二指肠同源盒1(PDX-1)、葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)、胰岛素(Ins)和胰高血糖素(GLu)等基因的水平,细胞免疫荧光测定胞浆Ins和GLu蛋白的表达,观察10nmol/L利拉鲁肽继续诱导7天对BM-MSCs向胰岛样细胞分化的作用。
　　3、以60mg/kg剂量腹腔注射STZ制备T1DM大鼠模型,造模成功后随机分为1型糖尿病模型对照组(T1DM组,n=10)、骨髓间充质干细胞治疗组(T1DM+BM-MSCs组,n=10)、利拉鲁肽治疗组(T1DM+LIRA组,n=10)、利拉鲁肽联合骨髓间充质干细胞治疗组(T1DM+LIRA+BM-MSCs组,n=10)四组。定期监测各组大鼠随机血糖水平以及一般情况变化;8周末,测定各组大鼠糖化血红蛋白(HbA1c)、24h尿量以及24h尿蛋白水平;采用ELISA法检测血清胰岛素、C肽、胰高血糖素、胃泌素、胆囊收缩素和胰升糖素样肽1等胃肠道激素的浓度;免疫组织化学染色检查胰腺组织胰岛素和胰高血糖素的表达。
　　结果:
　　1、显微镜下见分离的BM-MSCs形态均一、呈长梭形;流式细胞仪检测提示:分离的BM-MSCs高表达间充质干细胞表面标志CD29、CD90、CD73和CD105,而不表达造血干细胞表面标志CD34和白细胞表面标志CD45;BM-MSCs成骨及成脂诱导分化能力检测阳性。
　　2、添加利拉鲁肽或GLP-1诱导后BM-MSCs进一步呈聚集性生长,DTZ染色阳性;荧光定量PCR检测提示:与高糖加尼克酰胺诱导组比较,利拉鲁肽诱导组和GLP-1诱导组Nestin的mRNA含量明显减少(P<0.01),PDX-1、GK、GLUT-2、Ins以及GLu的含量均升高(P<0.05),利拉鲁肽诱导组与GLP-1诱导组比较,各基因含量均无明显差异(P>0.05);细胞免疫荧光检测提示:未诱导组和高糖加尼克酰胺诱导组BM-MSCs胞浆Ins或Glu蛋白表达阴性,利拉鲁肽诱导组和GLP-1诱导组BM-MSCs胞浆Ins和Glu蛋白均表达阳性。
　　3、一般指标:与T1DM组比较,T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三组大鼠随机血糖、HbA1c、24h尿量以及24h尿蛋白量均明显降低(P<0.01),其中各指标水平均以T1DM+LIRA+BM-MSCs组最低(P<0.05)。
　　胃肠道激素:与T1DM组比较,T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三组血清胰岛素、C肽、胃泌素以及胆囊收缩素的水平均明显升高(P<0.05);T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs两组胰升糖素样肽1的水平明显升高(P<0.05),胰高血糖素的水平明显降低(P<0.05),T1DM+BM-MSCs组胰升糖素样肽1和胰高血糖素的水平与T1DM组比较无差异(P>0.05)。与T1DM+BM-MSCs组比较,T1DM+LIRA组胰升糖素样肽1的水平升高(P<0.05),胰高血糖素的水平降低(P<0.05),胰岛素、C肽、胃泌素以及胆囊收缩素的水平无明显差异(P>0.05);T1DM+LIRA+BM-MSCs组胰高血糖素的水平降低(P<0.05),胰岛素、C肽、胃泌素、胆囊收缩素以及胰升糖素样肽1的水平均明显升高(P<0.05)。与T1DM+LIRA组比较,T1DM+LIRA+BM-MSCs组胰岛素、C肽、胃泌素以及胆囊收缩素的水平均明显升高(P<0.05),而胰升糖素样肽1和胰高血糖素的水平均无差异(P>0.05)。
　　相关性分析:8周末各组大鼠血清胰岛素水平与胃泌素(r=0.544,P<0.01)、胆囊收缩素(r=0.710,P<0.01)和胰升糖素样肽1(r=0.669,P<0.01)的水平呈正相关,与胰高血糖素的水平呈负相关(r=-0.506,P<0.01);血清胰高血糖素水平与胃泌素(r=-0.364,P<0.05)、胆囊收缩素(r=-0.433,P<0.01)和胰升糖素样肽1(r=-0.591,P<0.01)的水平呈负相关。
　　胰腺免疫组化:与T1DM组比较,T1DM+BM-MSCs、T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs三组胰岛素阳性占胰岛细胞面积比例均明显升高(P<0.01),其中以T1DM+LIRA+BM-MSCs组的阳性面积比例最高(P<0.01),T1DM+BM-MSCs组与T1DM+LIRA组比较,两组无明显差异(P>0.05);与T1DM组比较,T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs两组胰腺组织胰高血糖素阳性占胰岛细胞面积比例均明显降低(P<0.01),T1DM+BM-MSCs组无明显差异(P>0.05);与T1DM+BM-MSCs组比较,T1DM+LIRA和T1DM+LIRA+BM-MSCs两组胰腺组织胰高血糖素阳性面积比例均明显降低(P<0.01);与T1DM+LIRA组比较,T1DM+LIRA+BM-MSCs组胰腺组织胰高血糖素阳性占胰岛细胞面积比例降低(P<0.05)。
　　结论:
　　1、通过密度梯度离心联合差壁培养法可以一次性获得大量的BM-MSCs。
　　2、利拉鲁肽可以进一步促进BM-MSCs分化为胰岛样细胞,且诱导效果与GLP-1相当。
　　3、利拉鲁肽联合BM-MSCs移植治疗可通过提高T1DM大鼠机体的多种胃肠道激素水平和对胰岛β及α细胞功能进行双向调控,从而比两者单独治疗能够更好地改善大鼠糖代谢。

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前言

第一部分 正常SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养以及鉴定

引言

材料与方法

一、材料

二、方法

结果

一、BM-MSCs的分离、培养

二、BM-MSCs的鉴定

讨论

第二部分 体外研究利拉鲁肽在骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞中的作用

引言

材料与方法

一、材料

二、方法

三、统计学分析

结果

（一）BM-MSCs诱导过程的形态学变化

（二）双硫腙染色鉴定胰岛样细胞

（三）Real Time-PCR检测诱导后BM-MSCs各相关基因的表达情况

（四）细胞免疫荧光检测结果

讨论

第三部分 利拉鲁肽联合骨髓间充质干细胞移植治疗1型糖尿病大鼠

引言

材料与方法

一、材料

二、方法

三、统计学分析

结果

（一）各组大鼠实验前后一般情况以及血糖、糖化血红蛋白比较

（二）各组实验大鼠24h尿量及尿蛋白比较

（三）各组实验大鼠血清胰岛素（Ins）、C肽（C-p）、胰高血糖素（GLu）、胃泌素（GAS）、胆囊收缩素（CCK）和胰升糖素样肽1（GLP-1）水平的比较

（四）各组实验大鼠胰腺组织胰岛素及胰高血糖素表达比较

讨论

全文结论

参考文献

致谢

综述