AGEs通过CaMKIV、p38MAPK、NF-κB途径促进Jurkat细胞分泌IFN-γ

摘要

目的:晚期糖化终产物(AGEs)通过与特异性受体晚期糖化终产物受体(RAGE)结合,损伤血管内皮细胞、促进白细胞黏附、刺激血管平滑肌细胞增殖、促进炎症因子的表达等而加速动脉粥样硬化的发生。本课题组前期研究发现AGEs通过RAGE,p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK),核因子-κB(NF-κB)途径,促进Jurkat细胞分泌肿瘤坏死因а(TNF-а)、干扰素-γ(IFN-γ),并引起钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(CaMKIV)表达增加,因此本研究将进一步观察CaMKIV在AGEs诱导Jurkat细胞分泌IFN-γ中的作用,探讨RAGE胞内信号通路中起关键作用的信号分子。
　　方法:①常规方法制备AGEs。200μg/ml的AGEs作用于植物血球凝集素(PHA)(0.25μg/ml)预刺激48h后的jurkat细胞0、30、60min后,蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测胞浆及胞核CaMKIV的表达,计算CaMKIV的核浆比值,同时设RAGE抗体(1μg/ml)干预组、非特异性抗体IgG(1μg/ml)及牛血清白蛋白(BSA)(200μg/ml)对照组。②200μg/ml的AGEs作用于CaMKIV抑制剂(KN62)(10μM)预处理的Jurkat细胞24h,ELISA检测IFN-γ表达。③200μg/ml的AGEs作用于KN62(10μM)预处理的Jurkat细胞30min,Western blot检测检测IκB磷酸化表达水平。④200μg/ml的AGEs作用于KN62(10μM)预处理的Jurkat细胞30min,Western blot检测检测p38MAPK磷酸化水平的影响。
　　结果:①200μg/ml的AGEs作用于PHA预刺激的jurkat细胞30、60min后,Westernblot结果显示CaMKIV的核浆比值增大,提示AGEs能引起CaMKIV发生核转位,与BSA组及PHA对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);RAGE抗体能抑制AGEs诱导的CaMKIV核转位(P<0.05),而非特异性抗体IgG不能抑制AGEs诱导的CaMKIV核转位。②200μg/ml的AGEs作用于PHA预处理的Jurkat细胞24h后,IFN-γ的表达较BSA组及PHA组明显增多(P<0.01),KN62能抑制AGEs诱导的IFN-γ的表达(P<0.05)。③200μg/ml的AGEs作用于PHA预处理的Jurkat细胞30min后,p-IκB表达较BSA组及PHA组明显增多(P<0.01),KN62能抑制AGEs上调p-IκB(P<0.05)。④200μg/ml的AGEs作用于PHA预处理的Jurkat细胞30min后,p-p38MAPK表达较BSA组及PHA组明显增多(P<0.01),KN62能抑制AGEs诱导的p-p38MAPK的表达(P<0.01)。
　　结论:AGEs可通过RAGE诱导Jurkat细胞CaMKIV的活化,并且通过RAGE-CaMKIV引起NF-κB的激活及炎症因子IFN-γ的分泌,进一步研究证实CaMKIV与p38MAPK通路存在串话。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

一、细胞株

二、主要仪器及试剂

三．方法

四、统计分析方法

结果

一、 Western blot检测AGEs对Jurkat细胞CaMKIV核转位的影响

二、ELISA检测 KN62对AGEs诱导Jurkat细胞分泌IFN-γ的影响

三、 Western Blot检测KN62对AGEs诱导Jurkat细胞IκB磷酸化水平的影响。

四、Western blot检测KN62对AGEs诱导Jurkat细胞p38MAPK磷酸化水平的影响

讨论

1． AGEs诱导PHA预刺激的Jurkat细胞CaMKIV的活化

2． AGEs通过CaMKIV诱导Jurkat细胞分泌炎症因子IFN-γ

3． AGEs通过CaMKIV激活NF-κB

4． CaMKIV和p38MAPK信号通路存在串话

小结

结论

参考文献

致谢