5-HT6受体介导Jab1通路在癫痫大鼠合并认知障碍中的改变及机制

摘要

【目的】
　　通过5-HT6拮抗剂SB-271046进行干预,观察5-HT6受体介导的Jab1通路在Licl-PILO慢性癫痫大鼠合并认知障碍中的改变,以探讨其改善癫痫大鼠自发性发作和学习记忆的可能机制。
　　【方法】
　　1、实验动物分组:成年雄性SD大鼠分为两组:空白对照组(Vehicle组,n=10),氯化锂-匹罗卡品组(Lithium chloride-Pilocarpine,LiCl-PILO组,n=50)。首先根据注射LiCl-PILO后是否出现癫痫持续状态(Status Epilepticus,SE),出现SE者纳入实验,未出现SE和死亡者则剔除;然后再随机分为3组:模型组(HP-CD组)即侧脑室注射羟丙基-β-环糊精(Hydroxypropyl-β-cyclodextrine,HP-β-CD),4ul;10ugSB-271046药物组(10ug-SB组)即侧脑室注射N-[4-Methoxy-3-(4-methyl-1-piperazinyl)-phenyl]-5-chloro-3-methylbenzo-thiophene-2-yl-sulphonamide monohydrochloride(SB-271046)剂量为10ug,4ul;20ugSB-271046药物组(20ug-SB组)即侧脑室注射SB-271046剂量为20ug,4ul,30ugSB-271046药物组(30ug-SB组)即侧脑室注射SB-271046剂量为30ug,4ul。
　　2、制作LiCl-PILO癫痫模型:腹腔注射PILO30mg/kg(16-18h前腹腔注射LiCl127mg/kg),然后30min内连续观察大鼠是否有痫性发作,根据Racine分级,发作级数达到Ⅳ级或Ⅳ级以上持续时间>30min则判定为SE。Racine分级标准:0级无抽搐发作;Ⅰ级面部抽搐和孤立性阵挛;Ⅱ级Ⅰ级加节律性点头;Ⅲ级Ⅱ级加单侧前肢抽搐;Ⅳ级双侧前肢抽搐,伴站立;Ⅴ级全身强直-阵挛抽搐,并失去体位控制,持续出现Ⅳ级或Ⅳ级以上者判定为大鼠SE(30min内≥2次)。
　　3、采用Veliskova和Goffin.K等评分法观察癫痫大鼠慢性期自发性发作。Veliskova分级标准:①凝视和嘴唇阵挛②自动症③单侧前肢抽搐④双侧前肢抽搐⑤双侧前肢抽搐伴站立和跌倒⑥强直阵挛发作。Goffin.K分级:①-③部分性发作,④-⑥继发性全身性发作。
　　4、在脑立体定位仪帮助下,根据Watson《大鼠脑立体定位图谱》,在造模后2周侧脑室注入HP-β-CD或者SB-271046。
　　5、侧脑室注射药物后,分别在0.5,1,2,4,8,16小时断头取脑,用WesternBlot检测皮质、海马、纹状体部位的Jab1通路上的蛋白:Jab1、c-Jun和p-c-Jun。
　　6、造模后4周,用细胞凋亡原位检测法(Tunel/HRP)检测皮质、海马、纹状体部位的细胞凋亡情况。
　　【结果】
　　1、行为学结果:(1)造模成功率、存活率:第一批大鼠造模成功率为72.55％,存活率42.84%。第二批大鼠造模成功率为85%,存活率为52.94%。第三批大鼠造模成功率为83.4%,存活率为56.62%。(2)慢性期自发性发作的观察:癫痫组与药物组慢性期均有自发性发作,级数平均在3-4级。SB-271046干预后,自发性发作次数减少;与10ug-SB相比,20ug-SB组和30ug-SB组自发性发作次数明显减少。但是各组之间的发作级数无统计学意义。
　　2、Tunel/HRP检测结果:①与正常组比较,癫痫大鼠模型组中各部位(皮质、海马、纹状体)细胞凋亡数目均增多,以海马部位最为明显。②SB-271046药物干预后,各部位细胞凋亡数目减少,以海马最为明显,皮质次之。③SB-271046药物干预后,各剂量组细胞凋亡数目减少,以30ug-SB组最明显。
　　3、Western blot法结果显示:①SB-271046的药物效应具有时间及剂量依赖性,符合药物代谢动力学特点,其生物学效应至少维持16小时。②与正常组比较,癫痫大鼠模型中Jab1蛋白表达没有变化,而c-Jun的磷酸化水平增加,以海马最为明显。③SB-271046药物干预后,各药物组Jab1蛋白表达、c-Jun的磷酸化降低,以30ug-SB组最为明显。④SB-271046对海马部位Jab1蛋白表达的抑制作用最明显,对皮质部位c-Jun磷酸化程度的抑制作用最明显。
　　【结论】
　　1、慢性癫痫大鼠模型中细胞凋亡增加,c-Jun过度表达。
　　2、5-HT6R拮抗剂可以抑制细胞的凋亡,减少c-Jun的过表达。
　　3、5-HT6R拮抗剂具有时间、剂量依赖性,以及组织选择性。
　　4、SB-271046可能通过抑制Jab1通路来发挥生物学效应,从而改善癫痫发作及癫痫大鼠的学习记忆。

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前言

材料和方法

1、实验仪器、试剂及其配制

2、实验流程图及动物分组

3、动物模型的建立 [19]

4、SB-271046侧脑室注射

5、行为学观察

6、Western blot法检测皮质、海马、纹状体脑区的Jab1，c-Jun，p-c-Jun的蛋白表达水平

7、Tunel/HRP检测细胞凋亡

8、统计分析

结果

1、慢性期自发性发作情况

2、TUNEL/HRP法检测各组不同脑区神经元的凋亡情况

3、Western blot法测定20ug-SB组大鼠各个时间点皮质、海马、纹状体的Jab1通路的信号分子的改变情况

4、Western blot法测定侧脑室注射后2h后，大鼠各剂量组皮质、海马、纹状体Jab1通路上信号分子的变化

讨论

1、癫痫的反复自发性发作

2、5-HT6受体拮抗剂减少癫痫导致的细胞凋亡及其可能的机制

3、5-HT6R介导的Jab1细胞内信号通路

4、癫痫大鼠脑内c-Jun的改变及其可能的机制

5、5-HT6R拮抗剂改善癫痫大鼠认知功能障碍的其它可能机制

结论

1、慢性癫痫大鼠模型中细胞凋亡增加，c-Jun过度表达。

2、5-HT6R拮抗剂可以抑制细胞的凋亡，减少c-Jun的过表达。

3、5-HT6R拮抗剂具有时间、剂量依赖性，以及组织选择性。

4、SB-271046可能通过抑制Jab1通路来发挥生物学效应，从而改善癫痫发作及癫痫大鼠的学习记忆。

参考文献

5-HT6受体介导Jab1通路在癫痫大鼠合并认知功能障碍中的改变及机制

致谢