5-HT6受体介导cAMP/PKA信号通路改善癫痫大鼠合并认知损害学习记忆及机制探讨

摘要

【目的】观察PKA/cAMP信号通路分子的变化,探讨SB-271046改善氯化锂-匹罗卡品致癫大鼠学习记忆的可能机制。
　　【方法】
　　1、实验动物分组:清洁级成年雄性SD大鼠分成两组:Vehicle(n=6);模型组(n=18),选造模成功后按随机法分为三组:PILO组(n=6),10ugSB-271046组(n=6),20ugSB-271046组(n=6),另设Vehicle组(n=6)。
　　2、癫痫大鼠模型的建立:腹腔注射LiCl127mg/kg,16-18h后腹腔注射PILO30mg/kg,然后30min内连续观察大鼠是否有痫性发作,按Racine分级,发作级数达到Ⅳ级及Ⅳ级以上持续时间>30min则判定为癫痫持续状态(Status Epilepticus,SE),即癫痫造模成功,纳入实验,未出现SE和死亡者则剔除。
　　3、侧脑室给药:造模成功两周后,在脑立体定位仪帮助下,根据Watson《大鼠脑立体定位图谱》,用微量进样针给与大鼠侧脑室注射N-[4-Methoxy-3-(4-methyl-1-piperazinyl)-phenyl]-5-chloro-3-methylbenzo-thiophen e-2-yl-sulphonamide monohydrochloride(SB-271047),10ugSB-271046药物组(10ug-SB组)剂量为10ug,4ul;20ugSB-271046药物组(20ug-SB组)即侧脑室注射SB-271046剂量为20ug,4ul。PILO组给予侧脑室注射羟丙基-β-环糊精(Hydroxypropyl-β-cyclodextrine,HP-β-CD),4ul,给予对照。
　　4、留取标本,检测cAMP/PKA信号通路上的信号分子:AC、PKA、CREB、pCREB、BDNF的含量:侧脑室给药4h、8h后,灌注取脑,取海马、皮质、纹状体不同部位。ELISA方法检测各部位腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase,AC)、蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)含量。western blot方法定量检测皮质、海马、纹状体转录因子环磷酸腺苷反应单元结合蛋白(cAMP responsive elemt birdingprotein,CREB)、磷酸化环磷酸腺苷反应单元结合蛋白pCREB,脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor)BDNF含量,real-time PCR方法检测BDNF表达情况。
　　【结果】
　　1、ELISA方法检测AC和PKA结果显示:与正常组相比,侧脑室给药4h和8h后,模型组、10ug组和20ug组大鼠海马、皮质、纹状体AC和PKA的表达明显升高(p<0.05或p<0.01)。
　　2、Western blot方法检测pCREB、BDNF结果显示:与正常组、模型组相比,侧脑室给药4h和8h后,10ug和20ug组大鼠海马、皮质、纹状体pCREB明显升高(p<0.05或p<0.01);与正常组相比,模型组、10ug组和20ug组大鼠海马、皮质、纹状体BDNF小亚基、大亚基明显升高(p<0.05或p<0.01);模型组、10ug组和20ug组三组有依次降低的趋势(p<0.05或p<0.01)。
　　3、Real-time-PCR方法检测BDNFmRNA结果显示:与正常组相比,模型组、10ug组和20ug组大鼠海马、纹状体BDNFmRNA表达明显升高(p<0.05或p<0.01);模型组、10ug组和20ug组三组有依次降低的趋势(p<0.05或p<0.01);与正常组相比,模型组、10ug组和20ug组大鼠皮质BDNFmRNA表达降低(p<0.05),模型组、10ug组和20ug组三组有依次降低的趋势。
　　【结论】慢性癫痫大鼠模型发作可引起脑内BDNF升高,而SB-271046能够下调癫痫大鼠BDNF的表达,其作用机制可能通过介导PKA/cAMP信号通路来调节,从而来改善癫痫大鼠学习记忆。

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英文缩略词表（Abbreviations and acronyms）

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前言

材料和方法

1、实验仪器、试剂及实验步骤

2、动物模型的建立

3、SB-271046侧脑室注射

4、ELISA方法检测海马、皮质、纹状体脑区AC、PKA的表达含量

5、Western blot法检测海马、皮质、纹状体脑区的CREB、pCREB、BDNF表达水平

6、 Realtime-PCR法检测海马、皮质、纹状体BDNF的mRNA表达水平

7、统计分析

结果

1、PILO腹腔注射后大鼠癫痫发作的成功率及慢性期存活率

2、PILO腹腔注射后大鼠癫痫发作的行为学表现

3、ELISA方法检测大鼠侧脑室给药4h、8h后各组不同脑区海马、皮质、纹状体AC、PKA表达水平

4、Western blot法测定大鼠侧脑室给药4h、8h后各组大鼠不同脑区海马、皮质、纹状体的pCREB、BDNF蛋白表达

5、real-time PCR检测大鼠侧脑室给药4h、8h后各组海马、皮质、纹状体部位BDNFmRNA的表达情况

讨论

1、PKA与学习记忆

2、CREB与学习记忆

3、cAMP/PKA信号通路与学习记忆

4、BDNF与颞叶癫痫的关系

5、本实验的不足之处

结论

参考文献

SB-271046影响癫痫大鼠学习记忆的电生理学研究及机制探讨

致谢