从原始卵泡培育MII卵制备胚胎干细胞的可行性研究

摘要

目的:1.建立从原始卵泡培育具有良好发育潜能的MII卵的组织工程技术方案;2.从原始卵泡培育的MII卵制备胚胎干细胞。
　　方法:1.分别对出生21天的雌性小鼠或新生0.5天雌性小鼠卵巢异体移植21天的受体鼠腹腔注射PMSG10IU/只,44h后分别从21天的雌性小鼠卵巢或异体移植卵巢中用机械穿刺法分离COCs用于体外成熟培养。在小鼠卵母细胞体外成熟过程中分别采用胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)、血清替代物(KSR)作为蛋白添加物构成不同的培养体系,比较观察不同体系的卵母细胞成熟率、体外受精率和晚期囊胚发育率。2.新生鼠卵巢移植到宿主小鼠肾被膜下,21天时对宿主腹腔注射PMSG10IU/只,44h后用机械穿刺法分离卵巢移植物中的卵冠丘复合体,体外成熟培养16h,得到的IVM-MII卵进行体外受精,受精卵发育至囊胚时从内细胞团制备小鼠胚胎干细胞。
　　结果:1.三种不同体系在卵母细胞成熟、受精及晚期囊胚发育率上无显著差异(P>0.05);2.从移植物所获COCs在体外成熟后得到的IVM-MII卵,可受精发育至囊胚并分离出ICM,成功制备2批胚胎干细胞。其中1批所获干细胞系已传代至第6代,取第3代的干细胞做碱性磷酸酶及SSEA-1抗原检测,结果均为阳性,畸胎瘤试验结果表明所制备胚胎干细胞能分化为三个胚层来源的组织细胞;
　　结论:KSR、BSA均可替代FBS作为卵母细胞体外成熟体系的添加物使用,但KSR对卵丘的成熟和卵母细胞发育具有更好的综合优势。首次报道证实了新生鼠卵巢(卵泡募集前卵巢)异体移植联合体外成熟培养所获的成熟卵(MII卵)可用于制备小鼠胚胎干细胞系。

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前言

第一部分. 不同体外成熟体系对卵母细胞成熟及发育潜能的影响

1. 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 实验设备

1.3 实验试剂

1.5 收集生理卵巢中COCs用于体外成熟培养

1.6 收集移植物卵巢中COCs用于体外成熟培养

1.7 IVM-MⅡ卵的体外受精及早期胚培养

2. 结果

2.1体外成熟率比较

2.2 体外受精能力比较

2.3 胚胎发育能力比较

第二部分 人工培育IVM-MII卵制备胚胎干细胞

1. 材料与方法

1.1 实验动物

1.2实验材料

1.3 实验方法

1.9 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的传代培养

1.10 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的冻存

1.11 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的解冻复苏和饲养层制备

1.12 内细胞团（ICM）消化传代

1.13 ESC的消化传代

1.14 小鼠ESC的碱性磷酸酶染色鉴定

1.15小鼠ES细胞阶段特异性胚胎抗原1（SSEA-1）的免疫细胞化学鉴定

1.16 小鼠ESC体8内分化实验（小鼠ESC的肾囊移植）

1.17小鼠ESC体内分化肿物的取出、固定、切片及染色观察

2. 结果

2.1 移植卵巢收获量及COCs收获率

2.2 采KSR成熟体系获得IVM-MⅡ卵，体外受精后胚胎发育形态正常（见图2）。

2.3 取孕14.5天的ICR小鼠的胚胎经体外细胞悬液培养法可得到杂细胞少、生

2.4 ICM分离和ESC的建系

2.5 小鼠ESC碱性磷酸酶染色鉴定结果

2.5 小鼠ESC的阶段特异性胚胎抗原-1检测结果

3. 讨论

结论

参考文献

致谢

综述