N-Shc、Egr-4和KCC2在局灶性皮质发育不良Ⅱa型相关难治性癫痫灶未成熟神经元中的表达及相关机制研究

摘要

本文分两个部分进行探讨。
　　第一部分：Egr-4、N-Shc和KCC2在局灶性皮质发育不良Ⅱa型相关难治性癫痫中的表达及意义。
　　目的：探讨局灶性皮质发育不良Ⅱa型（FCDⅡa）相关难治性癫痫（IE)致痫灶中即刻早期反应基因-4(Egr-4)、衔接蛋白Shc（N-Shc）和K+-CL-转运体（KCC2）的表达情况及其意义。
　　方法：1、用免疫组化超敏二步法检测10例FCDⅡa相关IE组癫痫灶（实验组）与10例正常脑组织（对照组）中N-Shc和KCC2蛋白的表达。
　　2、FCDⅡa相关IE组癫痫灶和对照组正常脑组织各6例用 Western blotting法检测N-Shc蛋白的表达量。
　　3、应用Real-time qPCR法检测10例FCDⅡa相关IE组癫痫灶（实验组）和10例正常脑组织（对照组）N-Shc、Egr-4和KCC2的编码基因转录水平。
　　结果：1、免疫组化：对照组中神经元N-Shc和KCC2呈弱阳性表达，而实验组中形态异常神经元（DNs）呈强阳性明显。
　　2、Western blotting：实验组中的N-Shc的表达量明显高于对照组。
　　3、Real-time qPCR:与对照组比较，实验组中N-Shc、Egr-4和KCC2两种蛋白的编码基因转录水平均升高。
　　结论：1、DNs中N-Shc和KCC2表达异常增高可能与FCDⅡa相关IE的产生相关。
　　2、在FCDⅡa相关难治性癫痫中BDNF可能通过激活BDNF-SHC-KCC2和BDNF-EGR-KCC2两条信号通路导致DNs中KCC2的表达增高，引起神经元中氯离子浓度下降，最终介导GABA的抑制性效应发挥抑制癫痫的作用。
　　第二部分：N-Shc和KCC2在胎鼠未成熟皮质神经元原代培养中的表达及意义。
　　目的：探讨经BDNF干预后衔接蛋白SHC（N-Shc）和K+-CL-转运体（KCC2）在胎鼠未成熟皮质神经元中表达的情况及其意义。
　　方法：1、取怀孕18天（E18）的SD大鼠，采用水合氯醛腹腔注射麻醉，酒精消毒后剖宫取出胎鼠，并在解剖显微镜下去除软脑膜，运用浓度为0.125％的胰蛋白酶消化法加机械吹打法分离细胞并在无血清培养基进行细胞培养；体外培养的皮质神经元分为A组：未成熟组Ⅰ；B组：未成熟组Ⅱ；C组：成熟组； A1组：BDNF干预组未成熟组Ⅰ；B1组：BDNF干预未成熟组Ⅱ；C1组：BDNF干预成熟组。A组：培养第1天的胎鼠皮质神经元经无血培养基继续培养12小时；B组：培养第4天的胎鼠皮质神经元经无血培养基继续培养12小时；C组：培养第7天的胎鼠皮质神经元经无血培养基继续培养12小时；A1组：培养第1天的胎鼠皮质神经元加入BDNF（50ng/ml）干预并继续培养12小时；B1组：培养第4天的胎鼠皮质神经元加入BDNF（50ng/ml）干预并继续培养12小时；C1组：培养第7天的胎鼠皮质神经元加入BDNF（50ng/ml）干预并继续培养12小时；采用细胞免疫学法检测大脑皮质神经元的特异性烯醇化酶(NSE)的表达，在显微镜下观察皮质神经元的生长情况和纯度。应用RT-PCR法检测各组胎鼠皮质神经元的N-Shc和KCC2的编码基因转录水平。
　　2、缺氧条件下体外培养第4天胎鼠未成熟神经元分为D组：对照组、E组：BDNF干预组；正常条件下体外培养第4天胎鼠未成熟神经元分为D1组：对照组、E1组：BDNF干预组。D组：培养第4天胎鼠未成熟神经元加入CoCl2（100μmol/ml）干预并继续培养30分钟；E组：培养第4天胎鼠未成熟神经元加入CoCl2（100μmol/ml）干预并继续培养30分钟后再给予BDNF（50ng/ml）干预并继续培养；D1组：培养第4天的胎鼠皮质神经元经原培养基继续培养30分钟；E1组：培养第4天的胎鼠皮质神经元经原培养基继续培养30分钟后给予 BDNF（50ng/ml）干预并继续培养。采用氯离子荧光探针（MQAE）结合激光共聚焦显微镜测定细胞内氯离子荧光强度，并在显微镜下观察细胞形态。
　　结果：1、无血清培养1d和4d的胎鼠皮质神经元的形态学特征尚未发育成熟,细胞散在分布,少数细胞成团分布,胞体发亮,圆形或椭圆形。而无血清培养7d皮质神经元胞体饱满成锥体形且发亮，边缘有光晕，突起较多，末端彼此相互连接形成复杂的神经网络。光镜下观察，无血清培养7d的皮质神经元NSE抗体呈阳性表达，且实验组皮质神经元细胞纯度为均超过90%。
　　2、BDNF干预未成熟组Ⅰ、BDNF干预未成熟组Ⅱ和BDNF干预成熟组中N-Shc和KCC2两种蛋白的编码基因转录水平较相应未成熟组Ⅰ、未成熟组Ⅱ、成熟组升高（P＜0.01），差异具有统计学意义，其中BDNF干预未成熟组Ⅱ中N-Shc和KCC2蛋白的编码基因转录水平最高。
　　3、缺氧条件下：BDNF干预组与对照组相比培养30分钟后胎鼠未成熟皮质神经元氯离子荧光强度较强（P＜0.01），差异具有统计学意义。正常条件下：BDNF干预组胎鼠未成熟皮质神经元培养30分钟后氯离子荧光强度较对照组强（P＜0.01），差异具有统计学意义。
　　结论：1、无血清培养1d和4d的皮质神经元的形态学特征尚未发育成熟；7d皮质神经元发育较成熟。
　　2、各实验组皮质神经元的纯度均超过90%，适合细胞学实验。
　　3、在胎鼠未成熟皮质神经元中BDNF可能通过激活BDNF-N-Shc-KCC2通路，引起细胞中KCC2的表达升高。
　　4、通过对胎鼠未成熟皮质神经元的体外干预，模拟临床癫痫发作时缺氧的病理状态，我们认为缺氧条件下胎鼠未成熟皮质神经元中BDNF能够引起KCC2的表达升高。

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第一部分N-Shc、Egr-4和KCC2在局灶性皮质发育不良IIa型相关难治性癫痫中的表达及意义

前言

1、材料和方法

1.1 标本和一般资料

1.2 主要实验试剂

2、实验方法

2.1分组及石蜡切片制作

2 . 2 常规H E染色及N-Shc和KCC2的免疫组织化学染色。

2.3 Western blotting

2.4 Real-time qPCR

3、结 果

3.1 HE染色

3.2 Western blotting

3.2 Real-time qPCR

4、讨 论

参考文献

第二部分N-Shc和KCC2在胎鼠未成熟皮质神经元原代培养中的表达及意义

前言

1、材料和方法

1.1材料

2、实验方法

2.1皮质神经元体外培养

2.2体外培养神经元鉴定

2.3 Real-time qPCR检测胎鼠皮质神经元细胞中N-Shc和KCC 2的编码基因转录水平

2.4共聚焦显微镜下观察胎鼠未成熟皮质神经元中氯离子荧光强度

3、结 果

4、讨 论

参考文献

致谢

综述