姜黄素衍生物C213抑制线粒体Hsp90功能及抗白血病的作用

摘要

目的：研究姜黄素衍生物C213干扰线粒体Hsp90功能和抗白血病作用。
　　方法：
　　1.利用四甲基偶氮唑蓝(MTT）法检测 C213对 K562、HL60、MCF-7、SMMC-7721、HT-29、SW620、CNE2、SGC7901和KB等肿瘤细胞的增殖抑制作用。
　　2.通过western blot法和免疫共沉淀法对比C213与姜黄素Cur对热休克相关蛋白和Hsp90客户蛋白表达量的影响，来考察C213对白血病细胞中Hsp90分子伴侣功能的影响。
　　3.采用JC-1染色K562和HL60细胞，应用流式细胞仪来检测C213对白血病细胞线粒体膜电位影响；采用western blot方法，考察C213对K562和HL60细胞Caspase凋亡途径的影响；采用Annexin V/FITC凋亡试剂盒，应用流式细胞仪检测C213对K562和HL60细胞状态分布的影响。
　　4.应用线粒体蛋白提取试剂盒，提取K562和HL60细胞的线粒体蛋白，用各细胞器的标志蛋白检测线粒体蛋白的纯度；应用免疫共沉淀法，以 CypD抑制剂环孢菌素CsA和经典的胞浆Hsp90抑制剂为对照，考察C213对线粒体蛋白中Hsp90-CypD复合物的影响。
　　5.采用Western blot法检测C213对K562和HL60细胞周期蛋白因子的影响；通过PI染色，用流式细胞仪检测C213对白血病细胞周期分布的影响。
　　结果：
　　1.姜黄素衍生物C213在体外能抑制K562、HL60、MCF-7、SMMC-7721、HT-29、SW620、CNE2、SGC7901和KB等细胞的增殖，C213处理肿瘤细胞48小时后，MTT法测得IC50值在1-10μM之间，对白血病K562和HL60的效果最好，分别为1.01和0.87μM。
　　2.用K562肿瘤细胞裂解液，对Hsp90进行免疫共沉淀，与对照组相比，可引起与Hsp90结合的客户蛋白Akt和P210Bcr-abl的含量下降。通过C213（0.5,1,2μM）和Cur（2.5,5,10μM）分别处理K562细胞24h后，免疫印记显示细胞中的Hsp70的含量上升， Hsp90、p23和p60HOP的蛋白含量无明显变化，同时细胞中的Hsp90客户蛋白Bcr-Ab l、Akt的表达下降，并且呈剂量依赖关系。根据实验结果推测C213对Hsp90分子伴侣功能抑制的作用与C ur相似，并且活性要强于Cur。MG132是一个常用的蛋白酶体抑制剂，可以逆转由蛋白酶体途径引起的蛋白的降解，用C213作用于K5622h后，再加入MG132共同孵育2h。从免疫印迹的结果分析，MG132可以完全阻断由C213引起的Hsp90客户蛋白的降解。
　　3.0、0.5、1、2μMC213处理K562细胞发生线粒体膜电位变化的比例为：14.0％、21.6%、37.0%、43.7%，相同浓度的C213处理HL60细胞发生线粒体膜变化的比例为：14.3%、22.5%、42.4%、51.7%；2μMC213处理K562细胞0、15、30、60min后，发生线粒体膜变化的比例为：17.0%、21.8%、30.3%、39.7%，相同浓度的C213处理HL60细胞发生线粒体膜变化的比例为：15.7%、19.3%、31.5%、40.2%；0、0.5、1、2μMC213作用于K562和HL60细胞后，Caspase3和9及ParP下调，其裂解片段表达量上升，抗凋亡因子Bc l-2下调， CytC表达量上升；C213作用于K562和HL60细胞24h，随着药物浓度的增大，早期凋亡的细胞所占的比例越来越大。
　　4.用各细胞器的标志蛋白western blot检测证明提取的线粒体蛋白基本上可以排除其他细胞器中蛋白的干扰。对 HL60和 K562的线粒体蛋白进行 Hsp90免疫共沉淀，C213均可以显著地降低与Hsp90相结合的CypD，而Cyp D抑制剂环孢菌素 CsA和经典的胞浆 Hsp90抑制剂均不能干扰线粒体内的Hsp90-CypD复合物结合。
　　5. C213浓度的增大，细胞周期蛋白 CDK4和 CDK6没有明显的变化， Cdc2表达量下降，p21的表达量上调；由流式细胞仪测得，C213处理24h的白血病细胞K562和HL60表现出明显的G2/M期阻滞。
　　结论：
　　1.姜黄素衍生物C213对多种肿瘤细胞的恶性增殖具有明显的抑制作用。
　　2. C213能够干扰Hsp90分子伴侣功能，对热休克蛋白及 Hsp90客户蛋白的影响效果与Cur相似。
　　3. C213能够诱导白血病细胞K562和HL60进行线粒体凋亡，导致线粒体膜电位耗散，引起caspase级联反应，发生细胞早期凋亡。
　　4. C213能够特异性的干扰线粒体Hsp90功能，阻断Hsp90与CypD的结合。
　　5. C213能干扰白血病细胞K562和HL60的细胞周期运行，使细胞周期阻滞于G2/M期。

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英文缩略词表

前言

1. 立题依据

2、热休克蛋白90的研究背景和现状

3. 论文研究目标

材料与方法

1、材料和方法

1．1 实验仪器

1. 2细胞株

1. 3主要化学及生化试剂

1．4主要试剂的配制

1．5细胞培养材料

1．6抗体

1．7 SDS-PAGE 电泳材料

1．8 转移与印迹材料

2．实验方法

2．1 细胞的传代、冻存和复苏

2．2 MTT法测定体外抗癌细胞作用

2．3 线粒体蛋白的提取

2. 4流式细胞仪检测

2．5 蛋白浓度的测定

2．6 免疫共沉淀

2．7 蛋白样品的SDS-PAGE电泳

2．8 Western Blotting

2．9 统计学处理

实验结果

1. C213对肿瘤细胞增殖抑制作用的活性测定

2. C213 对白血病细胞中Hsp90分子伴侣功能的影响

3 C213诱导白血病细胞进行线粒体凋亡

4 C213对线粒体Hsp90的影响

5 C213对白血病细胞周期的影响

讨论

致谢：

参考文献

综述：

参考文献