舟山眼镜蛇神经毒素的分离纯化、活性测定及镇痛作用研究

摘要

目的：从江西产舟山眼镜蛇粗毒中分离并纯化得到电泳纯神经毒素组分,研究其受体动力学特性和镇痛作用。
　　方法：1.采用SP Sepharose Hign Performance阳离子交换色谱和Superdex30凝胶过滤色谱，两步快速分离法从江西产舟山眼镜蛇粗毒中提纯得到神经毒素组分，用离体大鼠膈神经-膈肌标本鉴定其性质，用SDS-PAGE(Tris-Tricine系统)电泳鉴定其纯度。
　　2.采用Meier法，测定小鼠腹腔注射眼镜蛇神经毒素的LD50近似值，通过离体蛙腹直肌标本，以维库溴铵(vecuronium bromide，Vec)为对照，研究眼镜蛇神经毒素与N2-AChR的相互作用。
　　3.选用3种测痛实验：电刺激－嘶叫法，热板法，醋酸扭体法观察眼镜蛇神经毒素的镇痛活性。
　　4.采用连续7日给药法观察眼镜蛇神经毒素镇痛作用的耐受性，采用纳洛酮催促戒断实验观察眼镜蛇神经毒素的成瘾性。
　　结果：1.眼镜蛇毒粗毒经过 SP Sepharose Hign Performance阳离子交换色谱得到21个蛋白峰，其中第IX峰（暂名为NNAV-IX）过Superdex30凝胶过滤色谱所得的第IV峰经鉴定为分子量为15kDa左右的神经毒素纯品，暂命名为NNAV-IX4。
　　2.小鼠腹腔注射NNAV-IX4的LD50近似值为0.501mg/kg。在NNAV-IX4作用下,ACh对蛙腹直肌的累积剂量-效应曲线平行右移。计算NNAV-IX4和Vec的拮抗参数pA2分别为7.33和6.48，NNAV-IX4和Vec的解离常数KD分别为0.0512μmol/L和0.330μmol/L。
　　3.NNAV-IX4的镇痛作用存在一定的量效关系和时效关系，NNAV-IX4腹腔注射给药后2h起效，5h达峰值。与 NS组比较，NNAV-IX4对3种小鼠疼痛模型的痛阈均能显著提高(P<0.05)。尤其是在小鼠电刺激－嘶叫法实验中，NNAV-IX4组给药后5h后可使小鼠痛阈提高了526.32％，而哌替啶组给药后1h小鼠痛阈只提高171.63%(P<0.05)。
　　4.与每天给药前相比，NNAV-IX4组小鼠连续7d给药后5h的痛阈值持续提高，并且在第7日痛阈达最高值(P<0.05)。吗啡组小鼠仅第1、2d用药后1h痛阈明显升高(P<0.05)，随后5d给药前后痛阈相比无显著性差异。与NS组比较，吗啡组小鼠纳洛酮催促戒断后体重减轻克数和平均跳跃次数均有显著差异(P<0.05)，而NNAV-IX4组无显著差异。
　　结论：1.舟山眼镜蛇毒粗毒经过两步分离得到目的蛋白NNAV-IX4为电泳纯的神经毒素。
　　2. NNAV-IX4对N2-AChR的拮抗性质为竞争性拮抗，其对N2-AChR的拮抗能力强于维库溴铵。
　　3. NNAV-IX4的镇痛作用强，它起效慢，达峰时间长。
　　4. NNAV-IX4的镇痛作用不易耐受，不成瘾。

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引言

Ⅰ.江西产舟山眼镜蛇毒神经毒素的分离纯化

1. 材料

2. 方法

3.结果

4.讨论

II．NNAV-IX4的活性测定

1.材料

2. 方法

3.结果

4.讨论

III．NNAV-IX4的镇痛作用研究

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

IV．NNAV-IX4的镇痛作用的耐受性和成瘾性研究

1．材料

2. 方法

3.结果

4．讨论

V．结论

参考文献

致谢

综述

参考文献