微沟槽钛表面抗菌肽生物涂层的抗菌性能及其对牙龈成纤维细胞生物学行为的影响

摘要

种植体颈部与植体周围软组织形成的软组织封闭对种植体长期成功率极为重要，它也是预防种植体周围炎重要因素之一。根据“the race for the surface”理论，在种植体生物材料的表面，细菌的粘附和组织的结合存在一个竞争的关系。如果组织细胞在竞争中占优那么就能形成良好的组织整合，反之亦然。因此为了形成一个良好的、有功能的软组织封闭，种植体颈部需具备以下两个性能：1、种植体颈部需对牙龈成纤维细胞（HGFs）具有较好的粘附和增殖诱导作用；2、种植体颈部需具备良好的抗菌性能。
　　目前研究发现，微沟槽结构的钛表面能够导致所谓的“接触诱导”，有利于HGFs的粘附、增殖，同时促进各种基因和蛋白的表达。大部分研究认为60μm宽、10μm深的微沟槽最适合种植体颈部设计。近年来抗菌肽的出现为种植体表面抗菌涂层的研究带来了新的思路，抗菌肽具有抗菌谱广、无组织细胞毒性、细菌不易产生耐药性等特点。通过将抗菌肽修饰到沟槽结构的钛表面，可以将两者结合起来并各自发挥其作用，形成良好的软组织封闭。
　　目的：
　　本课题通过3-氯丙基三乙氧基硅烷（CPTES）硅烷化这一生物活化方法将抗菌肽修饰到具有60μm宽、10μm深的微沟槽结构的钛表面，通过检测其理化性能确定其是否修饰成功，同时检测其机械稳定性；通过体外细菌培养观察其对牙龈卟啉单胞菌的抗菌效果；通过体外细胞培养评价其对HGFs的粘附、增殖的影响，并观察微沟槽结构所具有的“接触诱导”效应。
　　方法：
　　利用硅烷化的方法将抗菌肽GL13K共价修饰到微沟槽钛表面，通过X线能谱仪、场发射扫描电镜、原子力显微镜、接触角检测仪等对材料表面的元素成分、形貌、粗糙度及润湿性等理化性能进行检测，判断其修饰成功与否。修饰成功后通过比较物理吸附和硅烷化修饰抗菌肽在超声2h前后的抗菌肽荧光变化、表面元素的变化、接触角变化情况来检查其机械稳定性。将牙龈卟啉单胞菌接种到不同材料表面，通过吖啶橙染色检测粘附能力、平板计数检测杀菌能力、细菌活性检测等评价抗菌肽涂层的抗菌性能。将HGFs接种到不同材料表面，通过DAPI染色检测细胞的粘附能力、CCK8检测细胞增殖能力、免疫荧光和扫描电镜检测细胞形态和接触诱导效应。
　　结果：
　　（1）理化性能检测：微沟槽表面硅烷化修饰抗菌肽后，XPS显示其表面出现了抗菌肽所特有的N元素，且C元素的含量明显增加，证明了抗菌肽成功修饰。修饰后钛表面的粗糙度由原来的1.71±0.05nm增加到28.86±4.48nm；接触角由60.68±2.89?增加到101.6±6.75?，因此，修饰了抗菌肽GL13K的微沟槽钛表面表现为疏水性且更为粗糙。涂层机械稳定性检测：硅烷化后修饰抗菌肽的材料超声2h前后，其表面标记FITC荧光的抗菌肽几乎没有变化；而直接物理吸附抗菌肽的材料超声2h前后，其表面标记FITC荧光的抗菌肽明显减少，XPS与接触角检测的结果与荧光结果相似，都证明了硅烷化修饰的抗菌肽涂层具有机械稳定性。
　　（2）抗细菌粘附：在不同的材料表面接种相同浓度的牙龈卟啉单胞菌，分别培养12h、24h、72h后吖啶橙染色结果显示光滑、微沟槽、抗菌肽涂层的光滑或微沟槽材料表面其细菌的数量大致一样，说明在微沟槽钛表面增加的抗菌肽涂层并没有抗细菌粘附的性能。杀菌试验：将粘附在材料表面的细菌离心后稀释，接种到BHI琼脂培养基中培养，三个时间段都显示具有抗菌肽涂层的微沟槽材料表面的CFUs明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.001）。细菌代谢活性：细菌在材料表面培养三个时间段后，进行WST-8生物活性测试，发现具有抗菌肽涂层的微沟槽材料表面的OD值明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.001），与CFUs的结果几乎一致。证明了抗菌肽GL13K修饰到微沟槽材料表面后仍有很好的杀菌作用。
　　（3）细胞粘附：用DAPI染料对接种在光滑、微沟槽、抗菌肽涂层的微沟槽材料表面2h、4h、6h后的HGFs细胞核进行染色，并在荧光倒置显微镜下进行计数，发现2h时三种材料表面的细胞数量无差异；4h、6h时微沟槽组与抗菌肽涂层的微沟槽组材料表面的细胞数量均多于光滑组，差异具有统计学意义（P＜0.001）；6h时抗菌肽涂层的微沟槽组材料表面的细胞数量又多于沟槽组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。细胞增殖：所有时段抗菌肽涂层的微沟槽组表面细胞数量多于微沟槽组，且微沟槽组又多于光滑组，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。细胞形态和排列方向：微沟槽组和抗菌肽涂层的微沟槽组的HGFs呈细长型并沿着沟槽的方向平行排列，而光滑组的细胞呈椭圆形、不规则排列。
　　结论：
　　采用CPTEs硅烷化的方法将抗菌肽GL13K稳定地修饰在具有微沟槽的钛表面，其机械性能稳定性使其不被种植体植入时的旋转力及龈沟液流的压力所破坏。微沟槽钛表面修饰抗菌肽后，形成了一个微米级与纳米级混合的表面，不但具有良好的杀菌效果，还能促进细胞的粘附和生长。同时微沟槽结构所特有的“接触诱导”效应仍然保存。这一材料一方面具有杀菌性能，另一方面具有促进细胞粘附和增殖的生物活性，从两方面作用使之形成良好的种植体软组织封闭。

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前言

第一部分 抗菌肽GL13K修饰到微沟槽钛表面及其理化性能的研究和抗菌肽涂层机械稳定性的研究

实验一 抗菌肽GL13K修饰到具有微沟槽结构的钛表面

实验二 微沟槽钛表面硅烷化修饰抗菌肽涂层的机械性能稳定性检测与其表面修饰抗菌肽浓度的确定

第二部分 抗菌肽生物涂层对牙龈卟啉单胞菌的杀菌效果及其粘附、代谢活性的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 抗菌肽生物涂层对牙龈成纤维细胞的粘附、增殖、细胞形态、接触诱导效应的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

综述:抗菌肽生物涂层在口腔种植体中的应用

个人简历

致谢