隐丹参酮抗非小细胞肺癌转移的机制研究

摘要

目的：
　　肺癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌发病率在肺癌发病率中的比重超过80％。而复发转移是造成肺癌患者死亡的最主要原因。因此，预防肺癌细胞的转移能够控制肿瘤恶化、提高患者生存质量及延长患者寿命。近年来，隐丹参酮作为活血化瘀药丹参中主要的脂溶性成分二萜醌类化合物，其抗肿瘤活性受到高度重视。本课题选用2种人非小细胞肺癌A549和H460细胞株，首先检测了其整合素和E-cadherin的表达情况，进而研究隐丹参酮对非小细胞肺癌A549和H460细胞生长、侵袭迁移、细胞周期分布的影响，探讨整合素和E-cadherin在人非小细胞肺癌转移过程中的作用，为非小细胞肺癌的治疗提供新的靶点，为隐丹参酮治疗肺癌奠定理论基础。
　　方法：
　　（1）采用流式细胞术检测非小细胞肺癌A549、H460细胞中E-cadherin和β-integrin的表达。
　　（2）以5、10、15、20、30、40、60μmol/L的隐丹参酮作用于体外培养的非小细胞肺癌A549和H460细胞24h后，采用MTT法检测隐丹参酮对A549和H460细胞增殖活性的改变。
　　（3）以10、30、50μmol/L的隐丹参酮作用于体外培养的非小细胞肺癌A549和H460细胞24h后，采用划痕实验和Transwell实验分析隐丹参酮对非小细胞肺癌A549和H460细胞侵袭迁移能力的改变。
　　（4）以40μmol/L的隐丹参酮作用于体外培养的非小细胞肺癌A549和H460细胞48h后，采用流式细胞术检测隐丹参酮对非小细胞肺癌A549和H460细胞周期的进程及E-cadherin和β整合素表达情况的影响。
　　结果：
　　（1）A549细胞中β-integrin的平均荧光强度 MFI明显比 H460细胞的高;两细胞中E-cadherin的表达差异不大。经流式细胞仪筛选出整合素高表达瘤株 A549和整合素低表达瘤株 H460。
　　（2）MTT检测结果显示，隐丹参酮浓度超过5μmol/L即可对两细胞均呈现有效抑制增殖作用，并随药物浓度的增加，细胞存活率明显下降。当剂量超过20μmol/L，效果未见明显加强。隐丹参酮抑制A549和H460细胞增殖的IC50分别为（31.59±1.25）μmol/L和（42.45±0.75）μmol/L，隐丹参酮对整合素高表达瘤株 A549的增殖抑制作用更显著。
　　（3）划痕实验显示，实验组随隐丹参酮的浓度升高，细胞的划痕愈合速度减慢，细胞迁移能力受到了显著抑制，划痕宽度与对照组相比差异明显。
　　（4）Transwell实验显示，A549和H460细胞经隐丹参酮作用后，肿瘤细胞的体外侵袭能力明显下降。A549细胞实验结果：对照组细胞数为129.45±14.26个，实验组10、30、50μmol/L细胞数分别为85.36±11.22、45.82±7.32、36.21±3.12个。H460细胞实验结果：对照组细胞数为145.35±13.48个，实验组10、30、50μmol/L细胞数分别为96.25±13.46、55.35±8.42、45.21±5.32个。通过比较透膜细胞数可知，随隐丹参酮剂量增加，透膜细胞数减少，且隐丹参酮对整合素高表达瘤株 A549的侵袭抑制率更高。
　　（5）流式细胞术显示，A549和H460细胞经隐丹参酮作用后,细胞周期阻滞于G1期,G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降。与对照组相比,隐丹参酮干预后的A549、H460细胞表面 E-cadherin的表达上调，β-integrin的表达下降。
　　结论：
　　本课题首先筛选出整合素高低表达株，发现隐丹参酮对整合素高表达瘤株A549的细胞增殖抑制、侵袭迁移抑制作用都更强。进一步研究表明其对细胞增殖的抑制与周期阻滞有关。同时，隐丹参酮可以下调β整合素、上调E-cadherin的表达，说明隐丹参酮抑制非小细胞肺癌增殖、侵袭迁移的机制是整合素依赖，与E-cadherin有关。

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前言

第一部分 隐丹参酮对NSCLC细胞增殖抑制作用

第一节 流式细胞术检测A549、H460细胞中E-cadherin和β-integrin的表达

实验原理

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

第二节 MTT实验检测隐丹参酮对NSCLC细胞增殖抑制作用

实验原理

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

第三节 讨论和结论

1 讨论

2 结论

第二部分 隐丹参酮对NSCLC细胞侵袭迁移能力的影响

第一节 细胞划痕实验检测隐丹参酮对A549、H460细胞迁移能力的影响

实验原理

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

第二节 Transwell小室实验检测隐丹参酮对A549、H460细胞侵袭能力的影响

实验原理

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

第三节 讨论和结论

1 讨论

2 结论

第三部分 初步探讨隐丹参酮体外抑制NSCLC细胞增殖、侵袭迁移的作用机制

第一节 流式细胞术检测隐丹参酮对A549、H460细胞周期的影响

实验原理

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

第二节 流式细胞术检测隐丹参酮对粘附分子的影响

实验原理

1 材料

2 实验方法

3 实验结果

第三节 讨论和结论

1 讨论

2 结论

参考文献

综述: 隐丹参酮抗肿瘤转移的研究进展

致谢