阿托伐他汀抑制无血清缺氧条件下碘海醇诱导人肾小管上皮细胞凋亡的可能机制

摘要

目的：
　　研究Drp1介导的线粒体分裂与ROS介导的氧化应激在无血清缺氧条件下对比剂（CM）诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用及阿托伐他汀在此过程中的保护机制。
　　方法：
　　以人肾小管上皮细胞（HKC）为研究对象，进行无血清缺氧培养，分别与不同浓度（10、20、40、80、100、120、150、200 mgI/ml）碘海醇孵育2 h；同一浓度碘海醇（120 mgI/ml）分别处理细胞1、2、4、6、8、12 h及碘海醇（80 mgI/ml）分别处理细胞2、4、6、8、12 h；不同浓度碘海（10、20、40、80、120 mgI/ml）处理细胞2 h。不同浓度阿托伐他汀（10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L）预先与细胞孵育24 h，同一浓度阿托伐他汀（10-7 mol/L）预先与细胞孵育（6、12、24、36 h），阿托伐他汀10-7mol/L、与阳性对照组DPI（二联苯碘）10-5mol/L及NAC（N-乙酰半胱氨酸）10-5mol/L预先与细胞孵育24 h，三者分别再与碘海醇（120 mgI/ml）在无血清缺氧条件下共刺激2 h。采用MTT法检测细胞增殖能力；TUNEL法观察细胞凋亡数情况；采用化学法检测细胞上清液中微量丙二醛（MDA）含量与荧光检测单个细胞的ROS产生情况；RT-PCR法检测gp91phox、p22phox、Bax、Bcl-2及caspase-3等基因表达情况；Western-blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Drp1、Cytc、caspase-3等表达情况。
　　结果：
　　与正常对照组比较，不同浓度碘海醇组细胞增殖能力均受到不同程度抑制，其中10～40 mg组抑制不明显，而120、150、200 mgI/ml组，1、2、4、6、8、12 h组与HSF+CM组抑制最明显（P﹤0.05）；而ATO、DPI与NAC预处理后细胞增殖能力增高（P﹤0.05）。TUNEL法检测示与正常对照组比较，HSF组、HSF+CM组细胞凋亡数增加（P﹤0.05）；与HSF+CM组比较，ATO、DPI与NAC凋亡数明显减少（P﹤0.05）。检测MDA与ROS产生量显示，对比剂显著增加细胞MDA与 ROS产生（P﹤0.05）；而ATO、DPI与NAC显著降低MDA与ROS产生（P<0.05）。RT-PCR法检测显示：对比剂促使gp91phox、p22phox、Bax及caspase-3 mRNA表达上调，Bcl-2 mRNA表达下调；而ATO减少gp91phox、p22phox、Bax及caspase-3 mRNA的表达，增加Bcl-2 mRNA的表达，呈浓度依赖性（P<0.05）。Western-blot法检测示：对比剂呈浓度与时间依赖性促使Drp1表达（P<0.05）；ATO呈浓度与时间依赖性降低Drp1表达（P<0.05）。CM促使Bax、Drp1、Cytc、caspase-3表达上调（P<0.05），Bcl-2表达下调（P<0.05）；而ATO、DPI与NAC减少Bax、Drp1、Cytc、caspase-3的表达（P<0.05），增加Bcl-2的表达（P<0.05）。
　　结论：
　　在无血清缺氧条件下，碘海醇可能通过Drp1介导的线粒体分裂诱导HKC细胞凋亡，ATO可能通过抑制Drp1表达并减少 HKC细胞凋亡。同时，NADPH氧化酶来源的ROS参与碘海醇诱导HKC细胞凋亡，而ATO能抑制NADPH氧化酶的表达及其来源ROS介导的信号通路，并减少HKC细胞凋亡。

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主要英文缩略词

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英文摘要

一、前言

二、材料与方法

（一）材料

（二）方法

三、 结果

1. 倒置相差显微镜下对人肾小管上皮细胞形态学观察（×100）

2. MTT法检测细胞增殖

3. RT-PCR 法检测目的蛋白 mRNA表达水平

4. 阿托伐他汀、DPI与NAC预处理对碘海醇干预后细胞增殖与凋亡的影响

5. 氧化应激指标的检测

6. Western-blot 法检测目的蛋白的表达

7．Western-blot 法检测线粒体分裂蛋白Drp1的表达

四、讨论

1. 无血清缺氧条件下，碘海醇对人肾小管上皮细胞增殖与凋亡的影响

2. NADPH氧化酶及其相关的氧化应激阿托伐他汀保护碘海醇所致人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

3. 线粒体分裂机制与功能障碍在阿托伐他汀保护碘海醇所致人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

五．结论

参考文献

综述：对比剂肾病的防治进展

致谢