灵芝中性三萜组分的制备、质量控制及抗肿瘤活性的研究

摘要

目的：优化灵芝中性三萜组分的提取纯化工艺，建立灵芝中性三萜组分的质量控制方法，通过体内、外实验，评价灵芝中性三萜组分的抗肿瘤活性，并对其安全性进行初步研究，为灵芝三萜抗肿瘤新药的研发奠定基础。
　　方法：⑴通过单因素和正交试验，优化灵芝总三萜的提取工艺。⑵应用AB-8型大孔吸附树脂，对灵芝中性三萜组分进行富集纯化。⑶采用紫外-可见分光光度法（UV-vis）建立灵芝中性三萜组分中总三萜的含量测定方法。⑷运用反相高效液相色谱（RP-HPLC）技术，初步建立灵芝中性三萜组分的HPLC指纹图谱。⑸采用MTT法体外检测两种不同方法（溶剂法和树脂法）制备的灵芝中性三萜组分对人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人髓系-白血病细胞株HL60生长的抑制作用。⑹采用溶剂--熔融法，建立灵芝中性三萜固体分散体的制备方法。⑺分别建立小鼠H22和S180实体瘤以及腹水瘤的模型，观察灵芝中性三萜组分对这两种瘤株的抑瘤率（实体瘤）和生命延长率（腹水瘤）的影响，评价灵芝中性三萜组分体内抗肿瘤活性。⑼分别通过旷野法、金属棒法和倾斜板法，观察灵芝中性三萜固体分散体对小鼠自发活动及机能协调功能的影响；根据入睡率和睡眠时间来判断灵芝中性三萜固体分散体与戊巴比妥钠联用对小鼠的睡眠等神经系统方面的影响；使用生理机能记录仪记录给药前后灵芝中性三萜固体分散体对麻醉大鼠的呼吸频率、血压、心率等呼吸、心血管系统方面的影响。
　　结果：①通过正交试验筛选及考虑生产成本等因素，选定回流提取法最优条件为：6倍量95％乙醇提取3次，每次1.5 h。②使用AB-8型大孔吸附树脂对灵芝中性三萜组分进行富集纯化，以1 BV/h的流速上样，树脂径高比为1：10，按照上样液体积与树脂体积比为4:1进行动态吸附（上样液1 ml相当于原生药0.35 g），水洗至无色后，依次用4倍树脂柱体积的饱和 NaHCO3水溶液、水、60%和95%乙醇洗脱，洗脱流速为2 BV/h，收集95%乙醇洗脱液，浓缩真空干燥即得。③采用UV-vis，建立了灵芝中性三萜组分中总三萜的含量测定方法。④灵芝中性三萜组分的指纹图谱中可标定11个特征明显的共有峰，指纹图谱分离效果理想。⑤两种不同方法制备的灵芝中性三萜对 K562和 HL60细胞的增殖均有抑制作用，树脂法和溶剂法灵芝中性三萜作用于K562细胞48 h的IC50值分别是120.36μg/ml和149.36μg/ml，作用于HL60细胞48 h的IC50值分别是30.63μg/ml和24.49μg/ml。⑥采用溶剂-熔融法，以F68和44/14为载体（1:1），按药物与载体的比例为1:8制备灵芝中性三萜组分的固体分散体，从而改善三萜组分的水溶性。⑦灵芝中性三萜固体分散体的三个实验组均有显著抑制H22和S180实体瘤生长的作用（P<0.05），500 mg/kg组的抑瘤率分别为55.73%和53.58%；溶剂法制备的灵芝中性三萜固体分散体亦能显著抑制 H22、S180实体瘤的生长（P<0.05），但其500 mg/kg剂量的抑瘤率分别为21.22%和31.61%；非制备成固体分散体的灵芝中性三萜CMC-Na混悬液对H22、S180实体瘤的生长也有显著的抑制作用（P<0.01），其500 mg/kg剂量的抑瘤率分别为28.28%和23.31%；灵芝中性三萜固体分散体的三个实验组均能延长H22、S180腹水瘤小鼠的存活时间，且以中、高剂量组的生命延长率较为显著（P<0.05），500mg/kg组的生命延长率分别为35.4%和43.4%；溶剂法灵芝中性三萜固体分散体亦能显著延长 H22、S180腹水瘤小鼠的生存时间（P<0.05），500 mg/kg组的生命延长率分别为27.1%和32.8%；中性三萜CMC-Na混悬组能延长H22腹水瘤小鼠的生存时间，但对S180腹水瘤小鼠的生存时间的延长作用更为显著（P<0.05），500mg/kg组的生命延长率分别为15.1%和20.5%。⑧灵芝中性三萜固体分散体（250~1000 mg/kg）对小鼠的自主活动、机能协调功能、戊巴比妥钠阈下催眠剂量及戊巴比妥钠睡眠时间均没有明显的影响；对麻醉大鼠的呼吸和心血管系统无影响（125~500 mg/kg）。
　　结论：⑴经优化的提取方法，稳定可行，可用于灵芝总三萜的提取。⑵AB-8型大孔树脂吸附洗脱法具有选择吸附性强，富集效果理想，解吸条件较温和等优点，可用于灵芝中性三萜组分的富集纯化。⑶采用紫外-可见分光光度法建立的灵芝中性三萜组分的含量测定方法，该方法经典稳定，可作为灵芝中性三萜组分质量控制中的定量控制方法。⑷采用RP-HPLC法建立的灵芝中性三萜组分的指纹图谱，该方法可操作性强、重复性好，可用于灵芝中性三萜组分的定性质量控制。⑸两种灵芝中性三萜对 K562和 HL60细胞均有抑制增殖作用，表现出明显的量效关系，且这两种不同方法制备的灵芝中性三萜在体外对肿瘤细胞的抑制作用差别不大。⑹以F68和44/14为载体，采用溶剂-熔融法制备固体分散体，能提高灵芝三萜的分散性，改善灵芝三萜的水溶性，有望提高灵芝中性三萜组分的生物利用度。⑺灵芝中性三萜固体分散体对H22和S180这两种小鼠的瘤细胞不论是实体瘤还是腹水瘤，都有较强的活性；将灵芝中性三萜组分制备成固体分散体后抗肿瘤活性增加，提高了生物利用度；树脂法灵芝中性三萜的体内活性高于相同剂量的溶剂法灵芝中性三萜的体内活性，这也验证了大孔树脂吸附法用于灵芝中性三萜组分富集和纯化的可行性和优越性。⑻灵芝中性三萜固体分散体对动物的神经系统、呼吸系统和心血管系统的影响较小，在药效学有效剂量范围内安全性较高。

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前言

1 灵芝中性三萜组分的制备工艺研究

1.1 灵芝总三萜提取工艺的研究

1.1.1 材料

1.1.2 方法

1.1.3结果

1.1.4讨论

1.1.5 小结

1.2 灵芝中性三萜组分纯化工艺的研究

1.2.1 材料

1.2.2 方法

1.2.3 结果

1.2.4 讨论

1.2.5 小结

2 灵芝中性三萜组分质量控制研究

2.1灵芝中性三萜组分中总三萜的含量测定

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.1.3 结果

2.1.4 讨论

2.1.5 小结

2.2 灵芝中性三萜组分高效液相色谱指纹图谱的初步研究

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.2.3 结果

2.2.4 讨论

2.2.5 小结

3 灵芝中性三萜组分的体内外抗肿瘤活性的研究

3.1 灵芝中性三萜组分抑制肿瘤细胞增殖的研究

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.1.3 结果

3.1.4 讨论

3.1.5 小结

3.2灵芝中性三萜组分体内抗肿瘤作用

3.2.1 灵芝中性三萜固体分散体的制备

3.2.2 灵芝中性三萜组分对小鼠H22、S180移植瘤的抗肿瘤作用

4 灵芝中性三萜组分药物安全性的初步研究

4.1 材料

4.1.1药物与试剂

4.1.2 实验仪器旷野箱

4.1.3 实验动物

4.2 方法

4.2.1 对精神、神经系统影响的实验

4.2.2 对呼吸和心血管系统影响的实验[25,26]

4.2.3 分析方法

4.3 结果

4.3.1 对精神、神经系统影响的实验结果

4.3.2 灵芝中性三萜固体分散体对麻醉大鼠呼吸和心血管系统的影响

4.4 讨论

4.5 小结

参考文献

文献综述: 灵芝三萜的提取、纯化及药理活性的研究进展

致谢