前列腺癌患者外周血游离DNA GSTP1基因甲基化检测及其意义

摘要

目的：DNA甲基化是一种调节基因表达的重要机制，在肿瘤发生、发展中起重要作用。研究表明，在肿瘤诊断、预后及疗效判断方面，DNA甲基化是一种有潜在应用价值的肿瘤标志物。本研究运用自行建立的实时荧光定量PCR甲基化检测方法，检测前列腺癌患者外周血游离DNA中谷胱苷肽-S-转移酶P1(GSTP1)基因启动子区域甲基化表达情况，探讨其在前列腺癌早期诊断中的价值。 方法：收集入院治疗的患者的外周血样本，每位患者各2管，约2ml/管，置于-80℃超低温冰箱冻存。其中符合入组标准的样本分别为：行前列腺癌内分泌治疗患者58例作为A组，患者年龄波动于61～82岁，平均年龄72岁；因“排尿困难，发现PSA升高”入院就诊的患者42例作为B组，其中23例诊断为前列腺癌（B1），19例诊断为非前列腺癌(B2)，B组年龄波动于55~78岁，平均年龄70岁；非前列腺疾病患者34例作为C组，PSA在正常参考值范围内，为同期因尿道狭窄、肾结石、肾囊肿等良性疾病就诊的男性患者，其年龄波动于58~76岁，平均年龄68岁。运用甲基化特异性PCR法对三组患者GSTP1基因的表达情况进行定性检测，运用定量PCR检测GSTP1基因的甲基化相对表达量，统计分析其与前列腺癌患者主要临床病理特征之间的关系。 结果： 1.A组患者外周血游离DNA中GSTP1基因的甲基化相对表达量（M/U）为0.330973310±0.1848315242，B2组患者的相对表达量为1.585767684±0.8382501872，C组患者的相对表达量为2.354086941±2.1664719163，Welch检验P=0.000<0.05，所以A、B2、C三组总体均数不全相等。两两比较，A、B2两组总体均数间存在显著差异（P=0.000）；A、C两组总体均数间存在显著差异（P=0.000）；B2、C两组总体均数间不存在显著差异（P=0.230）。可认为A组患者GSTP1基因甲基化比值低于B2、C两组。 2.B1组患者GSTP1基因的甲基化相对表达量（M/U）为0.304547000±0.1905957866，与B2组比较分析，Welch检验P=0.000<0.05，两组总体均数间存在显著差异。 3.A组患者与B1组患者GSTP1基因的甲基化相对表达量比较分析，采用独立样本t检验，P=0.806>0.05，两组总体均数间无显著差异。 4.前列腺癌患者GSTP1基因甲基化程度与相应PSA相关性分析，Kendall’tau_b、Spearman’rho两种非参数方法检验，Kendall相关系数为0.198，Spearman相关系数为0.263，均为P<0.05，提示前列腺癌患者外周血游离DNA中GSTP1基因甲基化相对表达量与PSA相关性不显著（相关系数小于0.5）。 5.Gleason评分为5～7分和8～10分的GSTP1基因甲基化程度总体均数间无显著差异（P=0.930），危险度分级为中低危和中高危的GSTP1基因甲基化程度总体均数间无显著差异（P=0.241）。 结论： 1.前列腺癌患者和前列腺良性病变患者外周血游离DNA中GSTP1基因均存在甲基化和非甲基化表达； 2.前列腺癌患者外周血游离DNA中GSTP1基因甲基化表达量比值（M/U）较低，而良性病变患者（BPH等）的甲基化比值较高，推测是机体对肿瘤产生的反馈性保护作用； 3.内分泌治疗对前列腺癌患者外周血游离DNA中GSTP1基因甲基化相对表达量无影响； 4.前列腺癌患者外周血游离DNA中GSTP1基因甲基化相对表达量与PSA相关性不显著（r<0.5），可将其作为筛查前列腺癌的独立生物标记物； 5.检测患者外周血GSTP1基因甲基化相对表达量，虽然对前列腺癌的Gleason评分和危险度分级无预测作用，但对提高前列腺癌早期诊断准确率有一定价值。

目录

封面

声明

目录

论文中的中英文缩略词

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 材料

1.1 研究对象

1.2主要仪器设备及试剂

2.实验方法及步骤

2.1提取外周血游离DNA

2.2纯化DNA

2.3DNA修饰程序

2.4初步脱盐

2.5完成DNA修饰（脱磺酸基作用），再次脱盐，并洗脱

2.6甲基化特异性PCR（MSP）

2.7凝胶电泳

2.8实时荧光定量PCR（Real-time PCR）

2.9统计学分析

结果

1.MSP法凝胶电泳对GSTP1基因的定性检测

2.A、B2、C三组患者GSTP1基因定量PCR检测甲基化情况

3.B组患者GSTP1基因定量PCR检测甲基化情况

4.A组患者和B1组患者GSTP1基因定量PCR检测甲基化情况

5.前列腺癌患者外周血游离DNA中GSTP1基因甲基化程度与相应PSA相关性分析

6. 前列腺癌患者外周血游离DNA中GSTP1基因甲基化程度与Gleason评分和危险度分级的关系

讨论

结论

参考文献

综述:雄激素受体在雄激素依赖性前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌中表达的研究进展

致谢