ERα特异性抑制剂和激动剂对小鼠滋养外胚层分化的影响

摘要

目的： 观察雌激素受体α（ERα）在小鼠早胚细胞系分化期间的定位分布及其特异性抑制剂（MPP）和激动剂（PPT）对小鼠8-细胞胚体外发育至囊胚的影响；探讨MPP和PPT对小鼠囊胚形成过程中与滋养外胚层和内细胞团细胞系分化相关基因和蛋白表达的影响；为进一步阐明ERα在小鼠囊胚形成过程中的作用奠定基础。 方法： 1.分别取KM雌性小鼠和雄性小鼠（♀KM×♂KM）交配所得的8-细胞胚、桑葚胚以及囊胚。经免疫荧光染色后，用激光共聚焦显微镜观察ERα蛋白在以上各阶段早胚中的定位分布； 2.收集KM小鼠8-细胞胚： 1)置于KSOM培养液中体外培养，观察囊胚腔产生以及扩张的时间点； 2)置于含不同浓度MPP和PPT的培养液中体外培养，在上述各个时间点处观察并记录早胚的腔化率； 3)置于含MPP（5μM）和MPP（10μM）的培养液中培养24h，收集各组桑葚胚并用KSOM清洗三遍后，更换KSOM培养液继续培养，观察囊胚形成情况； 3.收集KM小鼠8-细胞胚，分别置于含KSOM、MPP（5μM）、PPT（10μM）的培养液中培养24h，获取体外发育的桑葚胚： 1)激光共聚焦显微镜观察 ERα和细胞系分化有关蛋白OCT4、CDX2、GATA3和TEAD4的定位和表达情况； 2) Realtime-PCR检测Tead4、Gata3和Cdx2 mRNA水平。 4.收集经不同浓度MPP处理24h的MCF-7（ERα阳性乳腺癌细胞系）细胞，利用CCK-8方法检测细胞增殖抑制率；收集经10μM MPP处理24h的MCF-7细胞，利用Western-blot检测ERα蛋白水平。 5.收集KM小鼠8-细胞胚，分别置于KSOM和含PPT（10μM）培养液中培养24h，获取体外发育的桑葚胚，经免疫荧光染色后，用激光共聚焦扫描显微镜观察紧密连接有关蛋白Occludin和粘附连接有关蛋白E-cadherin的定位和表达情况。 结果： 1.免疫荧光结果显示，ERα蛋白主要定位于8-细胞胚、桑葚胚和囊胚卵裂球胞核中；胞核ERα蛋白主要分布于桑葚胚外层细胞和囊胚滋养外胚层中； 2.24-30h是小鼠8-细胞胚体外培养下进行大规模腔化的时间段；ERα特异性抑制剂MPP（5μM、10μM）和激动剂PPT（10μM）分别抑制和促进早胚腔化（P<0.05）；培养24h换液后的MPP（5μM）组桑葚胚大部分能够继续发育至囊胚，并维持囊胚腔的扩张，而MPP（10μM）组桑葚胚无法形成囊胚（P<0.001）； 3.免疫荧光结果显示，MPP（5μM）组中，OCT4没有明显改变，但CDX2、GATA3荧光强度随着核 ERα蛋白的减少而减弱；Realtime-PCR结果显示，MPP（5μM）组中，Tead4、Gata3和Cdx2 mRNA水平明显低于KSOM组（P<0.05）；PPT（10μM）组中，无论是CDX2和OCT4的表达，还是与滋养外胚层分化有关基因的表达都没有明显改变； 4.CCK-8检测结果显示，MPP（10μM）明显抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.01）；Western-blot结果显示ERα蛋白总量没有明显改变。 5.免疫荧光结果显示，PPT（10μM）组中，Occludin蛋白的荧光强度明显增强，且分布于膜上的Occludin蛋白也多于KSOM组。 结论： ERα特异性抑制剂MPP以浓度依赖的方式抑制小鼠囊胚腔的产生，而适当浓度的ERα特异性激动剂PPT则促进腔化，提示ERα在小鼠囊胚形成过程中扮演重要角色。经MPP处理后，OCT4没有明显改变，而CDX2随着核ERα蛋白的减少也明显减弱。并且与滋养外胚层分化相关基因Tead4、Gata3和Cdx2的mRNA水平也显著降低，提示ERα通过调节滋养外胚层的形成影响小鼠早胚腔化。虽然本实验中 PPT对调节滋养外胚层分化相关因子的基因和蛋白表达没有影响，但与紧密连接有关蛋白Occludin的表达在PPT处理组中明显增强，提示ERα可能参与调节小鼠滋养外胚层极性的构建。

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材料和方法

1. 材料

2. 方法

结果

1. ERα在8-细胞胚、桑葚胚和囊胚中的表达

2. 8-细胞胚在体外培养下大规模腔化的时间段

3. MPP对腔化过程的影响

4. MPP对TE标志蛋白CDX2和ICM标志蛋白OCT4的影响

5. MPP对CDX2上游蛋白GATA3和TEAD4的影响

6. MPP对Tead4、Gata3和Cdx2基因表达的影响

7. PPT对腔化过程的影响

8. PPT对TE标志蛋白CDX2和ICM标志蛋白OCT4的影响

9. PPT对Tead4、Gata3和Cdx2基因表达的影响

10. Occludin蛋白在小鼠早胚发育各阶段中定位分布

11. PPT对紧密连接蛋白Occludin的影响

讨论

结论

参考文献

综述：小鼠囊胚滋养外胚层的形成与雌激素受体α

致谢