巴戟天多糖对1800MHz微波辐射致雄鼠生精障碍的保护作用及下丘脑Orexin-A神经元影响的研究

摘要

生殖是世间生物体新老更替、繁衍生息的必经过程，对人类而言，男性、女性共同组成了生殖这一过程的主体，任何一方产生疾病将导致生殖无法进行。目前，男性不育已得到广泛关注，调查显示，在不能受孕的夫妇中至少50％的因素来自男性生殖系统异常。 男性不育症的病因较为复杂，且伴随生活习惯、饮食结构及周围环境等的变化，影响因素也有所不同。近年，随着微波技术在人们生活、工作中的广泛应用，微波产生的辐射对健康产生的危害已得到越来越多的研究证实。生殖系统是微波辐射的敏感靶器官，一定频率的持续性微波辐射可引起男性不育症。近年来，有关微波辐射对男性生殖系统影响的相关理论处于不断完善中，但其发生机制尚不十分清楚。 中药巴戟天是茜草科植物巴戟天的干燥根，具有补肾阳、强筋骨等功效。本课题组前期研究发现，巴戟天水提物和醇提物对微波辐射所致生精障碍有一定效果。近年国内外学者对巴戟天的有效组分及其功效进行了一定的研究，巴戟天多糖作为主要成分之一，在抗氧化、提高免疫力及改善认知行为等方面发挥重要作用，但有关巴戟天多糖对微波辐射引起的生殖系统功能障碍的作用及机制如何鲜见报道。 针对以上科学问题，本课题集中研究了巴戟天多糖对1800MHz微波辐射致雄鼠生精障碍的保护作用以及对下丘脑orexin神经元的影响，以探讨巴戟天多糖的作用机制。本研究主要进行了以下三部分的工作。 第一部分1800MHz微波辐射导致SD雄鼠生精障碍的模型构建 目的：建立1800MHz微波辐射所致SD雄鼠生精障碍模型。 方法：按完全随机分组方法将雄鼠分为3组，即对照（Control）组15只、微波辐射组（MWR）55只和假辐射（Sham）组10只。MWR组雄鼠于每日8：00am~8：00pm暴露在1800MHz微波辐射箱内，功率密度为200μw/cm2，辐射周期为4周。Sham组雄鼠于每日8：00am~8：00pm置于微波辐射箱内，但并不打开辐射开关。Control组雄鼠置于无辐射源的大鼠笼内。三组均保证体位、摄食和饮水自由。观察三组雄鼠的体重、皮肤体毛及活动量和精神状态。检测三组雄鼠性行为学指标（爬背次数、射精次数、射精潜伏期）和精子参数（精子计数和精子畸形率）。分别采用透射电镜和HE染色观察三组雄鼠睾丸和附睾的组织结构。结果：辐射2w和4w后，三组大鼠体重比较差异无统计学意义（P＞0.05）。辐射4w后，MWR组雄鼠皮肤松弛，体毛枯黄、粗乱、干燥、光泽性差，鼠体后1/3段尤其明显，且雄鼠表现为狂躁不安、试图逃窜、易激惹及缩肩拱背的行为。与Control组和Sham组比较，MWR组雄鼠的爬背潜伏期和射精潜伏期明显延长，爬背次数和射精次数明显减少，精子计数明显降低，精子畸形率显著升高，以上差异均有统计学意义（P＜0.01）。与Control组和Sham组比较，MWR组见钙化灶和细胞核碎裂。与Control组和Sham组相比，MWR组见附睾头管腔不规则、直径变小，管壁较薄，腔内精子稀少、管腔变空，偶见碎片。 结论：本研究采取功率密度为200μw/cm2的1800MHz微波辐射在不影响雄鼠体重前提下，可降低其生精功能和性行为能力，引起睾丸和附睾损伤，成功制备了雄鼠生精障碍模型。 第二部分巴戟天多糖对1800MHz微波辐射所致SD大鼠生精障碍的保护作用 目的：探寻巴戟天多糖对生精障碍模型SD大鼠生殖系统的功效。 方法：按随机方法将所有大鼠分为4组，即对照组（Control组，10只）、辐射组（MWR组，10只）、巴戟天寡糖组（10只）、巴戟天多糖组（30只）。Control组不进行辐射和给药；MWR组行微波辐射，仅灌胃5mL双蒸水；巴戟天寡糖组在微波辐射后次日予巴戟天寡糖灌胃（2次/天，0.03g/次）；巴戟天多糖组在微波辐射后次日予巴戟天多糖（100mg/kg·d-1、200mg/kg·d-1和300mg/kg·d-1），均连续灌胃2周，剂量均5mL。测定各组雄鼠的睾丸、附睾湿重及系数。检测各组雄鼠的性行为学指标、精子参数。应用酶免疫吸附（Elisa）法测定各组雄鼠血清黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）和睾酮（T）水平。采取透射电镜和HE染色观察各组雄鼠睾丸和附睾组织结构。 结果：各组雄鼠的睾丸和附睾湿重及系数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与Control组比较，MWR组雄鼠的爬背潜伏期和射精潜伏期显著增多，爬背次数和射精次数显著减少，雄鼠的精子计数显著降低而精子畸形率显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。与MWR组比较：200mg/kg和300mg/kg巴戟天多糖组雄鼠在爬背潜伏期、射精潜伏期明显降低，爬背次数和射精次数方面明显增多，精子计数明显升高，而精子畸形率显著降低，以上差异均有统计学意义（P＜0.01）；与Control组比较：MWR组雄鼠血清中FSH和LH表达有所增减，而T水平明显降低（P＜0.01）；与MWR组比较：200mg/kg和300mg/kg巴戟天多糖组雄鼠血清中T水平显著升高（P＜0.05）。与MWR组比较：200mg/kg和300mg/kg巴戟天多糖组雄鼠睾丸生精细胞结构较完整，但300mg/kg多糖组见精子畸形；附睾头基底膜上皮连接较紧密，管腔细胞层次增加、排列整齐，管腔直径正常，管腔内精子量较多。而巴戟天寡糖组和100mg/kg巴戟天多糖组雄鼠睾丸和附睾头组织结构改善不明显。 结论：巴戟天多糖组对微波辐射所致SD雄鼠生精障碍在性行为学、精子参数、性激素水平及形态学方面起到改善作用，且200mg/kg巴戟天多糖组的效果更佳。 第三部分巴戟天多糖对微波辐射所致生精障碍SD大鼠下丘脑orexin A神经元的影响 目的：探讨巴戟天多糖对微波辐射所致生精障碍SD大鼠保护作用的可能机制。 方法：按随机方法将所有大鼠分为3组，即对照组（Control组，10只）、辐射组（MWR组，10只）、巴戟天多糖组（20只）。Control组不行辐射，仅予10mL双蒸水；MWR组行12h/天的微波辐射干预，为期4w，仅予5mL双蒸水灌胃；巴戟天多糖组在微波辐射后次日予巴戟天多糖（200mg/kg?d-1和300mg/kg?d-1），连续灌胃2周，剂量均5mL。尼氏（Nissl）染色观察各组雄鼠下丘脑和垂体的组织结构。应用免疫荧光染色观察orexin在下丘脑和垂体的表达。实时荧光PCR检测下丘脑组织中Orexin mRNA水平。代谢笼测定各组雄鼠的摄食和饮水量。结果：Nissl染色结果：MWR组雄鼠下丘脑阳性表达少于Control组，200mg/kg和300mg/kg巴戟天多糖组阳性表达有所增加；各组垂体组织未见无明显阳性增减。下丘脑Orexin A免疫荧光染色显示：Orexin A神经元主要位于穹窿周围，其阳性纤维分布广泛；与Control组比较，MWR组雄鼠下丘脑Orexin A神经元和弓状核Orexin A阳性纤维荧光强度明显增多（P＜0.01）；与MWR组比较，200mg/kg和300mg/kg巴戟天多糖组雄鼠下丘脑Orexin A神经元和弓状核Orexin A阳性纤维荧光强度明显减少（P＜0.01）；垂体未见Orexin A神经元及阳性纤维表达。实时荧光 PCR定量测定显示：与 Control组比较，MWR组雄鼠下丘脑Orexin A mRNA定量表达明显增多（P＜0.01）；与MWR组比较，200mg/kg和300mg/kg巴戟天多糖组雄鼠下丘脑Orexin A mRNA表达量均显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。与 Control组比较，MWR组雄鼠的摄食量和饮水量均明显增多（P＜0.01）；与MWR组比较，200mg/kg和300mg/kg巴戟天多糖组雄鼠的摄食量和饮水量均显著减少（P＜0.01）。 结论：巴戟天多糖对微波辐射所致的Orexin A神经元及其纤维在下丘脑和弓状核的过表达起到抑制作用，其中200mg/kg巴戟天多糖的作用更佳，可能是其对微波辐射导致生精障碍的保护机制之一。

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前言

第一部分1800MHz微波辐射导致SD雄鼠生精障碍的模型构建

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分巴戟天多糖对1800MHz微波辐射所致SD大鼠生精障碍的保护作用

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分巴戟天多糖对微波辐射所致生精障碍SD大鼠下丘脑Orexin A神经元的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：Orexin调节下丘脑-垂体-生殖轴的研究进展

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