基于ORF文库技术的乳腺癌吉西他滨耐药基因谱高通量筛选

摘要

目的：吉西他滨是晚期三阴性乳腺癌的重要一线化疗药物，肿瘤对其耐药可导致肿瘤进展。课题组前期构建了人三阴性乳腺癌耐吉西他滨的细胞株，发现 miR-484-CDA调控轴参与调控乳腺癌细胞对吉西他滨的敏感性；通过基因本体分析发现差异表达基因不仅与药物代谢相关，还可能通过多种途径调节吉西他滨的药物敏感性。如何高效地高通量探寻吉西他滨耐药基因是解决临床上吉西他滨耐药的重要基础。
　　方法：1.运用细胞毒实验检测吉西他滨对前期构建耐药细胞株 MDA-231-Gem的半数抑制浓度，验证耐药细胞株的稳定性。2.运用基因本体分析（GO分析）对耐药及其敏感细胞模型中 mRNAs表达谱变化情况进行数据分析，筛选出耐药相关候选基因。3.通过构建 DNA-条形码（Barcode）文库、人开放阅读框（ORF）文库及三阴性乳腺癌细胞吉西他滨耐药相关候选基因过表达质粒库，并通过慢病毒系统建立稳定过表达候选耐药基因的乳腺癌细胞株。4.运用高浓度吉西他滨筛选后，经二代测序分析平台及生物信息学技术筛选耐药靶点基因。5.通过实时荧光定量 PCR及细胞毒实验对耐药靶点基因进行验证，用 SPSS22.0统计软件对数据进行统计学分析。
　　结果：1. CCK-8细胞毒实验检测并验证了 MDA-231-Gem的耐药性的稳定， MDA-231-Gem细胞对吉西他滨的 IC50为21.85nM，IC50是其对照亲本细胞的12倍多（P<0.05）。2.表达谱芯片分析显示耐药相关基因有829个，基因本体分析显示，P<0.01集合共40个，包含基因228个，构成耐药相关候选基因集合。3.构建pDEST-Barcode文库，从ORF文库扩增耐药相关候选基因145个并构建耐药相关候选基因过表达质粒，将其按照等摩尔体积混合构建候选基因过表达质粒库。4.获得过表达候选基因的稳转细胞株 MDA-231-Lib及对照 MDA-231-Con，IC50分为66.96nM和3.47nM，有显著差异（P<0.05），候选基因与吉西他滨耐药具有较强相关性。5.二代测序结果显示，对照组与实验组14天Barcode reads数累计分布曲线，两条曲线稍微分出间隙，等量的过表达每个候选基因的细胞数目分布发生了变化。相关性分析显示，对照组7天与实验组7天、实验组14天，对照组14天与实验组7天、实验组14天的相关性最小。实验组14天/第0天中共筛到22个候选靶基因，实验组14天/对照14天中共筛到33个候选靶基因。6.定量 PCR结果表明，大部分的候选靶点基因在 MDA-231-Gem中表达倍数远大于 MDA-231。细胞毒实验验证本系统同时筛选到三个耐药靶基因 KCNN4，BCL2A1，TNFRSF11B，这三个基因的稳转细胞株的 IC50分别为60.27nM，30.20nM，15.95nM。
　　结论：1.构建了耐药相关候选基因过表达质粒库，并获得过表达乳腺癌细胞吉西他滨耐药相关候选基因的乳腺癌细胞株 MDA-231-Lib。2.获得二代测序结果，分析获得潜在耐药靶点基因，并验证出三个耐药靶基因 KCNN4，BCL2A1， TNFRSF11B。3.证明了pDest-Barcode文库高通量筛选功能基因的能力。

目录

声明

附录

前言

材料与方法

1材料

1.1主要仪器设备

1.2细胞培养所需试剂

1.3细胞增殖毒性检测所需试剂

1.4候选基因过表达质粒库的构建所需试剂

1.5二代测序所需试剂

1.6定量PCR所需试剂

1.7细胞株、菌株及质粒

2方法

2.1细胞培养与传代

2.2细胞毒实验检测药物对细胞的半数抑制浓度

2.3 DNA-条形码库（Barcode库）和带Barcode的目的载体质粒库的构建

2.4候选基因过表达质粒的构建

2.5候选基因过表达质粒库的构建。

2.6候选基因过表达质粒库的转染

2.7二代测序样本的制备

2.8 RNA提取、逆转录及实时定量PCR分析mRNA表达水平

2.9统计分析

结果

1 乳腺癌耐药细胞株MDA-231-Gem的验证及生物学分析

1.1耐药细胞株的验证

1.2耐药细胞株表达谱芯片数据分析

2 建立三阴性乳腺癌细胞吉西他滨耐药相关候选基因过表达质粒库，质粒库病毒包装后感染、吉西他滨耐药筛选

2.1建立三阴性乳腺癌细胞吉西他滨耐药相关候选基因过表达质粒库

2.2质粒库病毒包装后感染、吉西他滨耐药筛选

3 illumina? nextseqTM500二代测序和生物信息学筛选耐药靶点基因

4 不同候选耐药靶基因对乳腺癌细胞吉西他滨抵抗性的影响

4.1候选耐药靶点基因定量PCR分析验证

4.2 不同候选耐药靶基因对乳腺癌细胞吉西他滨抵抗性的影响

讨论

结论

参考文献

综述:高通量功能性基因筛选技术和条形码技术的发展及运用

致谢