小鼠哺乳期营养过剩对成年期胆固醇代谢影响探讨

摘要

目的：通过建立哺乳期营养过剩小鼠模型，观察哺乳期营养过剩对小鼠成年期肝脏胆固醇代谢影响，并摸索胆固醇代谢基因表达规律。
　　方法：哺乳期营养过剩模型通过调整母鼠母乳喂养子代的数量来建立。子代小鼠出生第5天去雌性留雄性,按照Mccance方法，将雄性幼鼠按体重随机分2组。母鼠母乳喂养3只的窝别成为小窝组（small litter，SL组），即模型组；母鼠母乳喂养10只的窝别称为正常组（normal litter,NL组）。母乳喂养至第3周后同时断乳，并继续给予普通饲料喂养至第9周，结束一个批次的实验，包括10只NL组小鼠和9只SL组小鼠，测量小鼠体重、空腹血糖，采集小鼠血样和肝脏。剩余NL组小鼠再次分组，NL组小鼠随机分为正常组（normal litter,NL组）和高脂组（high fat,HF组）。小窝组（small litter，SL组）不再分组，依旧给予正常饲料喂养。高脂组（high fat，HF组）作为阳性对照组，正常组（normal litter,NL组）作为正常对照组。高脂组（high fat,HF组）给予高脂饲料喂养。分别在第13周和第17周观察相应指标的变化。
　　小鼠血样和肝脏的处理如下：血样离心获得血清，并检测血清中下列指标含量：总甘油三酯（Total triglycerides，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMG-CoAR)、胆固醇7α-羟化酶(Cholesterol7-alpha hydroxylase,CYP7A1)。小鼠肝脏分为以下几个部分：1.取肝脏右侧大叶，置于冻存管中，液氮冷冻10min后转移至-80℃冰箱保存，用RT-PCR和Westernt Blot法检测下列基因的mRNA和蛋白表达水平：肝脏X受体α型（liver X receptor，LXR-α）、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator- activated receptor alpha，PPAR-α)、三磷酸腺苷结合盒转运体A1（adenosine triphosphatebinding cassette transporter A1，ABCA1）、三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ATP binding cassette transporter G1,ABCG1)和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMG-CoAR)。2.取肝脏左侧一小叶，用4%甲醛溶液固定，用以制备病理切片。3.左侧小叶称取0.2g，加1ml生理盐水匀浆，玻璃匀浆器匀浆后离心取上清液检测如下指标：3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMG-CoAR)、胆固醇7α-羟化酶(Cholesterol7-alpha hydroxylase,CYP7A1)以及总蛋白浓度。肝匀浆指标的检测结果将除以总蛋白浓度以进行标准化。
　　结果：
　　1.第3周，SL组的体重高于NL组，而且两组间的差异有统计学意义（p<0.05）。SL组的体长高于NL组，而且两组间的差异有统计学意义（p<0.05）。
　　2.第9周，SL组的体重和肝脏指数均高于NL组，而且两组间的差异有统计学意义（p<0.05）。SL组血清TC高于NL组，差异有统计学意义（p<0.05）。SL组肝匀浆HMG-CoAR含量高于NL组，且差异有统计学意义（p<0.05）。小鼠肝脏ABCA1、ABCG1、HMG-CoAR、LXR-α、PPAR-α基因的mRNA和蛋白表达水平均未发现有差异。
　　3.第13周，HF组的肝脏指数高于SL组，且差异有统计学意义（p<0.05）。NL组的血清TG高于HF组，且差异有统计学意义（p<0.05）。NL组的血清HMG-CoAR均值高于SL组，且差异有统计学意义（p<0.05）。SL组的血清CYP7A1高于NL组，且差异有统计学意义(p<0.05)。SL组肝匀浆HMG-CoAR高于NL组，且有统计学意义（p<0.05）；SL组肝匀浆 CYP7A1均高于NL组和HF组，且有统计学意义(p<0.05）。小鼠肝脏ABCA1、ABCG1、HMG-CoAR、LXR-α、PPAR-α基因的mRNA和蛋白表达水平均未发现有差异。
　　4.第17周，HF组的肝脏指数和空腹血糖均高于SL组和NL组，而且差异有统计学意义（p<0.05）。HF组血清TC高于SL组，而且差异有统计学意义(p<0.05)。NL组血清CYP7A1高于HF组,而且差异有统计学意义(p<0.05)；NL组血清CYP7A1高于SL组，而且差异有统计学意义(p<0.05)。HF组的ABCA1基因的mRNA的表达水平高于NL组，而且差异有统计学意义（p<0.05）。HF组的LXR-α基因的mRNA的表达水平高于NL组，而且差异有统计学意义（p<0.05）。SL组的LXR-α基因的mRNA的表达水平明显高于NL组，而且差异有统计学意义（p<0.05）。另外，SL组的PPAR-α基因的mRNA的表达水平高于NL组和HF组，而且差异均有统计学意义（p<0.05）。HF组的ABCG1基因蛋白表达水平高于NL组，且差异有统计学意义（p<0.05）。NL组的LXR-α基因蛋白表达水平明显高于SL组，且差异有统计学意义（p<0.05）。HF组的PPAR-α基因蛋白表达水平低于NL组，且差异有统计学意义（p<0.05）。SL组的PPAR-α基因蛋白表达水平明显高于NL组和HF组，且差异有统计学意义（p<0.05）。
　　结论：
　　1.小鼠哺乳期营养过剩会造成其成年期肝脏胆固醇合成能力增高，同时提高其肝脏将胆固醇代谢为胆汁酸的能力。
　　2.小鼠哺乳期营养过剩会造成小鼠成年期肝脏LXR-α和PPAR-α基因mRNA的高表达。还会造成肝脏PPAR-α基因的蛋白水平高度表达。同时造成LXR-α基因的蛋白水平低表达。

目录

声明

英文缩略词表

前言

第一部分 哺乳期营养过剩对小鼠生长发育及胆固醇代谢影响

引言

材料与方法

1试剂耗材

2仪器设备

3研究方法

4观察肝组织病理改变

5统计分析

结果

1小鼠哺乳期营养过剩模型的情况分析

2 NL组、HF组和SL组成年期血清生化指标、肝匀浆生化指标及相关指标分析

3成年期小鼠肝组织病理分析

讨论

第二部分 哺乳期营养过剩对成年期胆固醇代谢影响机制探讨

引言

材料与方法

1试剂耗材

2仪器设备

3研究方法

4 ABCA1、ABCG1、HMG-CoAR、LXR-α、PPAR-α基因mRNA和蛋白检测

5统计分析

结果

1 NL 组、HF 组和 SL 组成年期小鼠肝脏 ABCA1、ABCG1、HMG-CoAR、LXR-α、PPAR-α基因的mRNA转录水平分析。

2 NL 组、HF 组和 SL 组成年期小鼠肝脏 ABCA1、ABCG1、HMG-CoAR、LXR-α、PPAR-α基因蛋白表达水平分析。

讨论

总结

参考文献

致谢

综述：MDR3与肝脏疾病