shRNA敲减TLR4对乳腺癌细胞紫杉醇敏感性的影响

摘要

目的：
　　1.针对TLR4的shRNA重组慢病毒转染乳腺癌细胞，鉴定沉默TLR4基因表达效果。2.检测乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231中细胞生长抑制率、细胞周期的变化，观察干扰TLR4基因后MCF-7、MDA-MB-231细胞对紫杉醇作用的敏感性变化。3.检测MCF-7、MDA-MB-231细胞TLR4通路中相关蛋白的表达水平，探讨干扰TLR4基因后乳腺癌细胞紫杉醇作用敏感性变化的相关发生机制。
　　研究方法：
　　1.重组慢病毒分别感染MCF-7和MDA-MB-231细胞株，Western blot检测TLR4基因的沉默效果。
　　2．采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法，检测紫杉醇对转染目的质粒、阴性对照质粒的MCF-7细胞(MCF-7/shTLR4， MCF-7/shControl)及MDA-MB-231细胞(MDA-MB-231/shTLR4，MDA-MB-231/shControl)的生长抑制的影响。
　　3．流式细胞术(FCM)检测紫杉醇作用24h后，乳腺癌细胞MCF-7/shTLR4， MCF-7/shControl及MDA-MB-231/shTLR4，MDA-MB-231/shControl的细胞周期的分布情况。
　　4． Western blot检测紫杉醇作用24h后，乳腺癌细胞MCF-7/shTLR4， MCF-7/shControl及MDA-MB-231/shTLR4，MDA-MB-231/shControl细胞中下游信号因子相关蛋白NF-κB、IL-6、VEGFa的表达。
　　结果：
　　1.TLR4基因的沉默效果鉴定：Western blot检测结果表明：与转染阴性对照质粒的细胞（shNC）相比，稳定转染的三种质粒的细胞（sh1、sh2、sh3）TLR4蛋白的水平均明显降低(P<0.01），其中MCF-7以sh2相对蛋白表达下降最明显以及MDA-MB-231以sh3相对蛋白表达下降最明显。
　　2.紫杉醇对MCF-7细胞的生长抑制：在不同浓度的紫杉醇作用24h后，转染阴性对照质粒的细胞（MCF-7/shControl）和TLR4沉默的MCF-7/shTLR4细胞存活率均出现明显下降，具有浓度依赖性，并且MCF-7/shTLR4与MCF-7/shControl细胞相比较，同一浓度下细胞存活率下降更显著，差异具有统计学意义（P<0.001）。
　　3.紫杉醇对MDA-MB-231细胞的生长抑制：在不同浓度的紫杉醇作用24h后， MDA-MB-231/shControl和TLR4沉默的MDA-MB-231/shTLR4细胞存活率均出现明显下降，具有浓度依赖性，并且 MDA-MB-231/shTLR4与 MDA-MB-231/shControl细胞相比较，同一浓度下细胞存活率下降更显著，差异具有统计学意义（P<0.001）。
　　4.紫杉醇对 MCF-7细胞的生长周期影响：MCF-7/shTLR4、 MCF-7/shControl细胞生长周期阻滞于 G2／M期，并使 MCF-7/shTLR4阻滞表现更明显；与MCF-7/shControl细胞相比，PXL处理的沉默TLR4基因的MCF-7/shTLR4细胞又可进一步促进PXL作用，使生长周期明显阻滞于G2／M期。结果提示沉默TLR4基因与PXL在MCF-7细胞生长周期阻滞中具有协同作用。
　　5紫杉醇对 MDA-MB-231细胞的生长周期影响：PXL作用可促进MDA-MB-231/shTLR4、MDA-MB-231/shControl细胞生长周期阻滞于G2／M期，并使 MDA-MB-231/shTLR4阻滞表现更明显；与 DMSO处理的MDA-MB-231/shControl细胞相比，PXL处理的MDA-MB-231/shTLR4细胞又可进一步促进PXL作用，使生长周期明显阻滞于G2／M期。结果提示沉默TLR4基因与PXL在MDA-MB-231细胞生长周期阻滞中也具有协同作用。
　　6.紫杉醇干扰MCF-7细胞NF-κB、IL-6、VEGFa蛋白的表达情况：（1）在PXL5nM处理下，沉默TLR4表达的MCF-7/shTLR4细胞可以磷酸化NF-κB p65和p50，但主要抑制p-p65的表达，降低了NF-κB的活化，并显著减少了IL-6蛋白的表达，但未降低VEGFa蛋白的表达。（2）在对照组DMSO处理下，MCF-7细胞可以磷酸化NF-κB p65和p50，相对少量表达NF-κB、IL-6和VEGFa，无统计学差异。（3）MCF-7/shTLR4细胞分别加入PXL、DMSO处理，PXL处理组的p-p65/p65及p-p50/p50蛋白相对表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）； IL-6及VEGFa蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.001）。（4）MCF-7/shControl细胞分别加入PXL、DMSO处理，PXL处理组的p-p65/p65、p-p50/p50蛋白相对表达和IL-6蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.001）。VEGFa蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.01）。
　　7.紫杉醇干扰MDA-MB-231细胞NF-κB、IL-6、VEGFa蛋白的表达情况：（1）（4）紫杉醇激活了TLR4，导致了NF-κB、IL-6和VEGFa的表达；沉默TLR4降低了紫杉醇对乳腺癌细胞NF-κB、IL-6和VEGFa的表达，增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。在PXL10nM处理下，沉默TLR4表达的MDA-MB-231/shTLR4细胞可以磷酸化NF-κB p65和p50，并显著降低NF-κB的活化、IL-6蛋白及VEGFa蛋白的表达。（2）在对照组DMSO处理下，MDA-MB-231细胞可以磷酸化NF-κB p65和p50，相对少量表达NF-κB、IL-6和VEGFa，无统计学差异。（3）MDA-MB-231/shTLR4细胞分别加入PXL、DMSO处理，PXL处理组的p-p65/p65及IL-6蛋白相对表达升高，差异有统计学意义（P<0.01）；p-p50/p50蛋白相对表达无差异（P>0.05）；VEGFa蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.001）。（4） MDA-MB-231/shControl细胞分别加入PXL、DMSO处理，PXL处理组的p-p65/p65、p-p50/p50蛋白相对表达、IL-6及 VEGFa蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.001）。
　　结论：
　　（1）重组慢病毒可以稳定干扰乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231中TLR4基因的表达，以MCF-7 sh2和MDA-MB-231 sh3相对蛋白表达下降最明显，可用于后续的实验研究。
　　（2）TLR4抑制紫杉醇对乳腺癌细胞增殖，沉默 TLR4可以增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性，并具有浓度依赖性。
　　（3）紫杉醇使乳腺癌细胞周期阻滞G2/M期，沉默TLR4可以显著增强紫杉醇对乳腺癌细胞周期的阻滞。沉默TLR4与紫杉醇在乳腺癌细胞生长周期阻滞作用中具有协同作用。
　　（4）紫杉醇激活了TLR4，导致了NF-κB、IL-6和VEGFa的表达；沉默TLR4降低了紫杉醇对乳腺癌细胞NF-κB、IL-6和VEGFa的表达，增强乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。

目录

声明

英语缩略表

前言

材料与方法

1. 材料

2、实验方法

结果

1. Western blot检测乳腺癌细胞TLR4的沉默效果

2. MTT检测紫杉醇干扰乳腺癌细胞的生长抑制

3. FCM检测细胞周期

4. Western blot检测紫杉醇干扰乳腺癌细胞的下游信号因子（NF-κB、IL-6、VEGFa）蛋白的表达情况

讨论

结论

参考文献

综述:TLR4与肿瘤进展

致谢