泛素样修饰活化酶3对炎性因子表达的调控作用与机制

摘要

Neddylation修饰是一种类泛素化修饰，参与生物体内多种生理活动，包括细胞周期、DNA转录、信号通路的活化等。UBA3是Neddylation活化酶E1的亚单位，UBA3的重要性不言而喻。随着人们对Neddylation修饰的关注逐渐增加，对UBA3的研究和相关报道也越来越多。
　　NF-κB通路是调控炎症的一条重要的信号通路，但是NF-κB通路调控抑炎因子（例如IL-10）和促炎因子（IL-6、TNF-α等）的方式并不相同，IL-10的表达受p50形成的同源二聚体的调控，IL-6、TNF-α等促炎因子的表达受p50/p65异源二聚体的调控。p65、c-Rel和RelB存在能够激活转录的转录激活域，形成的同源二聚体或异源二聚体均具有促进基因转录表达的作用。p50和p52不具有转录激活域，其形成的同源二聚体可以通过与其他的二聚体竞争转录结合位点，从而起到抑制促炎因子转录的作用。虽然p50形成的同源二聚体能够抑制促炎因子的表达，但是却能够上调抑炎因子IL-10的表达。
　　为了明确UBA3在炎性因子表达的调控作用与机制，本课题分别对UBA3在炎性因子表达中的作用以及UBA3对炎症反应调控的机制进行了研究。在UBA3髓系敲除小鼠和IL-10敲除小鼠中，通过内毒素休克模型，明确了UBA3在炎性因子表达中的作用。在细胞系中，利用免疫共沉淀以及截短突变等实验初步分析了UBA3调控炎症的机制，明确了UBA3的作用位点。实验结果如下：
　　1、UBA3在髓系细胞中的缺失对内毒素休克的影响
　　本课题给UBA3髓系敲除小鼠腹腔注射LPS25mg/Kg，构建内毒素休克模型，记录死亡率，检测血清中炎性因子的表达水平，结果显示，注射LPS72h内， UBA3Δmye小鼠死亡率明显高于 UBA3F/F小鼠，且 UBA3Δmye小鼠 IL-6和 IL-1β表达明显上调，IL-10表达下调，说明UBA3缺失后，炎症反应加剧，UBA3具有抑制炎症的作用，且可能通过IL-10来调控炎症。
　　2、IL-10在UBA3缺失小鼠中加重炎症反应中的作用分析
　　进一步我们培育IL-10和UBA3双敲小鼠，并利用该种小鼠构建内毒素休克模型，记录死亡率，检测血清中炎性因子的表达水平。结果显示，注射LPS12h后，IL-10-/- UBA3F/F小鼠死亡率与 IL-10-/- UBA3Δmye小鼠死亡率没有差别，且IL-10-/-UBA3Δmye小鼠TNF-α明显下调，表明当IL-10敲除后，缓解了UBA3缺失引起的炎症反应，说明UBA3通过IL-10来影响炎症反应。
　　3、UBA3在炎性因子表达中的机制探讨
　　课题利用免疫共沉淀以及截短突变对 UBA3的调控炎性因子表达的机制进行了初步研究。结果表明，UBA3具有非Neddylation的功能，UBA3能够与KPC1结合，KPC1能与p105相结合，且UBA3能够促进KPC1与p105的相互作用，提示UBA3促进p105的泛素化，剪切形成p50。通过截短突变实验，确定了UBA3作用位点为活性腺苷酸化结构域，即第247aa至352aa。
　　结论：UBA3参与炎性因子表达的调控，抑制炎症反应，其机制可能为：UBA3通过与KPC1的结合，促进KPC1与p105的相互作用，促进p105泛素化后剪切生成p50，p50形成的二聚体抑制促炎因子的表达，同时促进抑炎因子IL-10的表达，从而抑制炎症反应。

目录

声明

缩略词表

前言

1. Neddylation修饰

2.活化酶E1的亚单位UBA3

3. 条件性基因敲除小鼠模型

4. NF-κB通路与p50

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2主要试剂

1.3仪器设备

1.4引物设计

2 试验方法

2.1 小鼠繁殖

2.2 小鼠基因型鉴定

2.3 小鼠腿骨细胞的分离

2.4 内毒素休克模型构建

2.5 小鼠血清的收集

2.6 Western Blot

2.7 免疫共沉淀

2.8 Elisa

2.9 质粒转化

2.10 质粒提取

2.11 截短突变体构建

实验结果

1 UBA3在髓系细胞中的缺失对内毒素休克的影响

1.1 UBA3髓系细胞条件性敲除小鼠基因鉴定

1.2 UBA3缺失小鼠内毒素休克死亡率统计

1.3 UBA3缺失小鼠炎症因子的表达水平

2 IL-10在UBA3缺失小鼠加重炎症反应中的作用分析

2.1 IL-10和UBA3双敲小鼠基因型鉴定

2.2 IL-10-/-UBA3Δmye小鼠内毒素休克死亡率统计

2.3 IL-10-/-UBA3Δmye小鼠炎症因子表达水平

3 UBA3调控炎性因子表达的机制探讨

3.1 敲低UBA3影响p50的表达

3.2 UBA3调控p50的表达不依赖于NEDD8

3.3 UBA3调控p50的表达依赖于KPC1

3.4 UBA3、p105和KPC1三者之间的相互作用

3.5 UBA3与KPC1结合位点

讨论

1 UBA3在炎性因子表达中的作用

2 UBA3调控炎性因子表达的机制探讨

结论

参考文献

综述：NF-κB1 p50蛋白的生物学功能

致谢