Bardet-Biedl综合征致病基因筛查及发病机制研究

摘要

Bardet-Biedl综合征(Bardet-Biedl Syndrome，BBS)是一种罕见的常染色体隐性遗传病，常涉及多器官多系统病变，具有复杂多变的临床表现。BBS的主要临床表现包括肥胖、视网膜色素变性、智力低下、多指(趾)、性腺发育不全和肾功能异常等。该疾病危害极大，患者预后差，具有高致残率，一旦发病，患者几乎无法正常生育后代。目前BBS的分子致病机制仍未完全清楚，尚无有效治疗措施。避免近亲结婚及有效的产前筛查仍是目前BBS的重要预防措施。筛查BBS的致病性基因突变并创建完整的BBS基因突变图谱，是开发产前筛查手段和临床基因治疗的基础，具有重要的临床意义。
　　目的：
　　对所发现的一BBS家系进行详尽的眼科专科和全身检查以确认患者表型，通过目标区域外显子的高通量测序技术寻找可能的致病基因及其突变位点，采用Sanger测序验证基因突变的来源以明确其致病基因及其位点，并进一步构建含所发现新突变的质粒，转染至成人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19），分别在蛋白水平和细胞水平探讨其分子发病机制。
　　方法：
　　1.研究对象为厦门大学附属厦门眼科中心就诊的两名以视网膜色素变性首诊的BBS患者，对该BBS家系所有成员进行详尽的病史采集、眼科及全身检查；
　　2.抽取家系成员外周血，按照试剂盒方法提取全血基因组DNA；
　　3.通过目标区域外显子的高通量测序技术，采用一个性化定制与145个遗传性视网膜疾病相关的基因芯片，筛查了该家系中2名患者DNA样品中的突变信息，并通过与参考数据库进行比对并进行生物信息学分析，发现可能的致病性突变；
　　4.针对高通量测序技术所发现的突变所处基因位置，设计引物，并对正常人群、该家系中表型正常的患者父母和患者的DNA样品进行Sanger测序验证，以明确突变来源；
　　5.构建了含此基因突变的真核细胞表达质粒，采用阳离子脂质体转染技术转染至成人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）和人胚肾细胞株（HEK293T）两种细胞。
　　6.采用免疫共沉淀法在蛋白水平检测了突变型BBS7蛋白与其它BBSome复合物相关蛋白，包括BBS1，BBS4，BBS5，BBS8和BBS9蛋白的相互作用能力；
　　7.采用CCK-8试剂盒法和流式细胞仪技术探究了突变型BBS7对ARPE-19细胞增殖、细胞周期与细胞凋亡的影响，并通过免疫印迹（Western blot）法和透射电镜技术探究了突变型BBS7诱导ARPE-19细胞凋亡的分子机制。
　　结果：
　　1.该家系现存2代成员，共收集了4名成员的临床资料，其中2名患者具有明显的早发性视网膜色素变性、多指多趾畸形、智力发育迟缓、肥胖和生殖系统发育不全等五项BBS主要体征，同时还伴有斜视、牙齿排列不齐和发育障碍等多项次要体征，符合BBS的诊断标准，可确诊为BBS。BBS在该家系中呈现典型的常染色体隐性遗传特征，符合BBS的遗传方式。
　　2.目标区域外显子的高通量测序技术筛选结果表明，在与遗传性视网膜疾病相关的145个基因中，2名患者DNA样本均在BBS7基因第5外显子检测到1个纯合突变：c.389_390delAC，该突变导致氨基酸改变p.N130fs（移码突变），并导致终止密码子的提前出现。相关生物信息学分析结果表明该突变为此家系中BBS的疑似致病性突变。
　　3.Sanger测序验证结果显示在患者父本及母本中均在相同基因的同一位置发现了该杂合突变，但在正常人对照中未发现此变异信息，确认了位于BBS7第5外显子区域的突变（c.389_390delAC）是该家系的BBS致病性基因突变。
　　4.免疫共沉淀研究结果表明，与野生型BBS7相比，突变后的BBS7蛋白与其它几种BBSome复合体组成蛋白，包括BBS1，BBS4，BBS5，BBS8和BBS9蛋白之间的相互作用及结合存在明显异常，可能导致无法形成功能正常的BBSome复合体，最终导致BBS表型的发生。
　　5.细胞水平研究发现，对比野生型BBS7，突变后的BBS7显著抑制了视网膜色素上皮细胞ARPE-19的增殖，细胞培养三天后的抑制率达11%。与细胞增殖实验结果相一致，细胞凋亡水平证实，突变型BBS7显著促进了ARPE-19的细胞凋亡。与转染野生型质粒的细胞相比较，转染突变型质粒的细胞凋亡率提高了88倍。然而突变型BBS7并未对ARPE-19细胞的细胞周期产生明显影响。进一步Western-blot检测结果表明转染突变型质粒后细胞内活化的caspase3和caspase9水平显著提高，而对Caspase8蛋白表达未观察到明显差异。细胞透射电镜（TEM）结果也显示转染突变型质粒的ARPE-19细胞内观察到明显的线粒体裂解，而转染野生型质粒组线粒体形态正常，这些结果表明BBS7基因的c.389_390delAC突变主要通过线粒体途径而不是细胞膜途径诱导RPE-19的细胞凋亡。
　　结论：
　　所确诊的BBS家系中2名患者均在BBS7基因上发现c.389_390del AC纯合突变，该突变文献尚未报道过。并得出该突变的分子致病机制可能为c.389_390delAC突变影响了BBS7蛋白与BBS1，BBS4，BBS5，BBS8，BBS9等蛋白的结合能力，导致无法形成BBSome复合物，造成纤毛功能障碍，进而通过抑制靶细胞增殖，并促进细胞凋亡，从而最终导致BBS发病。本研究首次报道了一种新的BBS致病性突变，进一步完善了已知BBS相关致病基因突变图谱，是开发产前筛查手段和临床基因治疗的基础，具有重要的临床意义，并且有望为该家系突变携带者的优生优育提供较为可靠的建议。此外，该研究明确了所发现突变的分子致病机制，加深了人们对BBS7基因与其功能的认识，有助于进一步研究BBS分子致病机制。

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