浒苔多糖抗四氯化碳肝损伤机制研究

摘要

目的：
　　研究浒苔多糖（Enteromorpha's polysaccharide，EP）对四氯化碳所致肝损伤的保护作用及其可能机制。
　　方法：
　　1、以雄性ICR小鼠为实验对象，将84只小鼠随机分为6组：正常组（Normal），模型组（Model），浒苔多糖低剂量组（LCEP）、浒苔多糖中剂量组（MCEP）、浒苔多糖高剂量组（HCEP）及阳性对照组（Silymarin）。Normal组和Model组灌胃（Intragastric administration，ig）生理盐水；LCEP、MCEP、HCEP组分别ig给予150mg/kg、300mg/kg、450mg/kg的浒苔粗多糖的水溶液；Silymarin组给予140mg/kg水飞蓟素水分散液，ig剂量均为10mL/kg体重（body weight，B.W），灌胃时间为28d。6组均采用基础饲料喂养。末次给药1h后腹腔注射（Intraperitoneal injection，ip）0.1％四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl4）橄榄油溶液，撤饲料，禁食不禁水16h。眼球取血并计算肝脏系数。
　　2、测定血清中谷丙转氨酶（Alanine transaminase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate transaminase,AST）、总胆红素（Total bilirubin,TBIL）、血尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）指标值，苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE）观察肝脏组织结构，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（Terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）计数肝组织细胞凋亡率。肝匀浆，并测定其中的谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPx）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、过氧化氢酶(Catalase from micrococcus lysodeiktic,CAT）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）等生化指标。
　　3、实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）测定肝组织中Nrf2、NQO-1、CSE、CBS、3-MST、TLR2、TLR4、TLR9、NF-kB p65、IL-1β、TNF-α、TGF-β、Pin1、Fas、Fasl、Bax、Bcl-2基因的表达量。蛋白质印迹法（Western-Blot）测定胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionine-γ-lyase,CSE）、胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase,CBS）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemotacticprotein1,MCP-1）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）、环氧化酶-2（Cyclo-oxgenase-2,COX-2）、核因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor2,Nrf2）、p-Nrf2、血红素氧化酶-1（Hemeoxygennase-1,HO-1）、含热蛋白结构域3受体（Nucleotide-binding oligomerization domain like receptor family,pyrindomain containing3,NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Cysteine aspartic acid specific protease-1,Caspase-1）、消化道皮肤素D（Gasdermin D,GSDMD）、CleavedGasdermin D蛋白表达水平。
　　结果：
　　1、CEP对CCl4致小鼠急性肝损伤的宏观水平保护作用
　　采用0.1％CCl4橄榄油溶液一次性腹腔注射后，与Normal组相比，Model组小鼠肝脏系数、血清ALT和AST酶活性、TBIL、H2S含量较高（P＜0.05）；血清BUN含量较低（P＜0.01）；肝组织病理学检查可见肿胀的肝细胞、消失或者固缩的细胞核、炎症细胞浸润，细胞凋亡率较高（P＜0.01）；肝组织GPx、SOD、CAT活性、GSH含量较低（P＜0.01），LDH活性、MDA含量较高（P＜0.05）。与Model组相比，LCEP、MCEP、HCEP组及Silymarin组肝脏系数、血清ALT和AST酶活性、TBIL、H2S含量较低（P＜0.05），肝组织GPx、SOD、CAT活性、GSH含量较高（P＜0.05），LDH活性、MDA含量较低（P＜0.05），肝组织病理学检查可见肿胀的肝细胞、少量炎症细胞浸润，细胞凋亡率较低（P＜0.01）。
　　2、CEP对CCl4致小鼠急性肝损伤的分子水平保护作用
　　与Normal组相比，Model组小鼠HO-1、CSE、CBS、TLR2、LTR4、TLR9、Pin1、NF-kB p65、TNF-α、TGF-β、Fas、Bax、IL-1β基因表达量较高（P＜0.05）；肝组织中CSE、CBS、iNOS、COX-2、IL-6、MCP-1、NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D、CleavedGasdermin D蛋白表达量较高（P＜0.001）；p-Nrf2、HO-1蛋白表量及p-Nrf2与Nrf2蛋白表达的比值较低（P＜0.001）；Nrf2、NQO-1、3-MST、Fasl、Bcl-2基因表达量及Nrf2蛋白表达量差异不显著（P＞0.05）。与Model组相比，LCEP、MCEP、HCEP组及Silymarin组CSE、CBS、TLR2、LTR4、Pin1、NF-kB p65、TNF-α、TGF-β、Fas、Bax、IL-1β基因表达量较低（P＜0.05），MCEP、HCEP组NQO-1基因的表达量较高（P＜0.05），Silymarin组Bax基因低于Model组（P＜0.05），但仍高于Normal组（P＜0.05），HCEP组TLR2、TLR4基因的表达量低于Normal组（P＜0.05）；LCEP、MCEP、HCEP组及Silymarin组CSE、CBS、iNOS、COX-2、IL-6、MCP-1、NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D、CleavedGasdermin D蛋白表达量较低（P＜0.05）；p-Nrf2、HO-1蛋白表量及p-Nrf2与Nrf2蛋白表达的比值较高（P＜0.05）；Nrf2、3-MST、TLR9、Fasl、Bcl-2基因表达量及Nrf2蛋白表达量差异不显著（P＞0.05）。
　　结论：
　　1、本实验条件下，采用0.1%CCl4橄榄油溶液可以建立小鼠急性肝损伤模型，可以升高小鼠体内转氨酶的活性以及血清中总胆红素、减少血尿素氮含量，引起小鼠肝脏系数的增高，出现明显的肝组织损伤的病理改变。
　　2、浒苔多糖可以明显减轻CCl4所致的急性肝损伤状态，可以降低血清中的转氨酶活性和总胆红素、增加血尿素氮含量，降低肝脏系数，改善肝组织的病理生理状态。
　　3、CCl4致小鼠急性肝损伤可能跟其抑制机体内抗氧化防御系统有关，而浒苔多糖可通过加强机体内抗氧化防御系统，改善肝损伤病理生理状态。
　　4、浒苔多糖可能通过Nrf2通路发挥抗氧化作用。
　　5、CCl4通过H2S/CSE、H2S/CBS体系增加血清中H2S含量，浒苔多糖干预可通过该体系减弱该过程。
　　6、CCl4可以通过Pin1/NF-kB通路发挥致肝损伤作用，浒苔多糖可通过该通路发挥抗肝损伤作用。
　　7、浒苔多糖可以通过TLRs/NF-kB通路发挥抗肝损伤作用。
　　8、CCl4可通过Fas/Fasl、Bax/Bcl-2通路，引起小鼠肝组织凋亡，浒苔多糖可以通过这两条通路发挥抗凋亡作用。
　　9、CCl4可能通过NLRP3/Caspase-1/Gasdermin D信号通路引起小鼠肝组织细胞焦亡，浒苔多糖可能通过该通路拮抗这种作用。

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