肺高压大鼠中NADPH氧化酶介导5-HT源性ROS释放的作用

摘要

在血管系统中活性氧（reactive oxygen species,ROS）主要由NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX）产生的，它会诱导氧化应激，导致机体氧化还原状态的紊乱，进而引起机体氧化损伤。氧化还原信号的改变以及ROS蓄积在细胞内会导致包括肺高压（pulmonary hypertension,PH）在内的一系列慢性病。研究表明，5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）与肺动脉高压（pulmonary arterialhypertension,PAH）发病机制有密切联系，能促进肺血管平滑肌增生，肺动脉血管收缩和局部微血栓形成。本研究通过野百合碱（Monocrotaline,MCT）腹腔注射和慢性低氧（Chronic Hypoxia,CH）持续诱导构建PH大鼠模型，比较NOX亚型蛋白或mRNA表达变化，利用5-羟色胺诱导大鼠肺动脉平滑肌（pulmonary aterial smoothmuscle cells,PASMCs）内ROS产生，运用NOX特异性抑制剂处理正常PASMCs，分别从mRNA和蛋白水平、细胞水平，探讨NOX亚型在介导5-HT源性ROS释放中的作用及其在肺高压中的作用，为PH发病机制研究提供新的理论依据。
　　研究目的：探究NADPH氧化酶中NOX不同亚型在不同肺高压模型大鼠中表达是否发生变化，及5-HT对ROS的调控作用。
　　研究方法：SD大鼠分别采用MCT一次性腹腔注射（50mg/kg）和CH两种方式诱导PH的发生，采用：①血流动力学检测方法，测定大鼠右心室收缩压（right ventricular systolic pressure,RVSP）、右心室重量指数（right ventricular mass index,RVMI）；②RT-PCR和Western blot检测方法，测定大鼠PAs标本NADPH氧化酶相关基因蛋白和mRNA表达水平；③5-HT酶联免疫吸附测定方法，测定不同肺高压模型大鼠血清和细胞内5-HT浓度；④荧光探针DCFH-DA活性氧检测方法，检测PASMCs内ROS，观察NOX特异性抑制剂对5-HT诱导的CON大鼠PASMCs内ROS升高的影响。
　　研究结果：①与正常组相比，PH模型大鼠的RVSP及对应的RVMI均显著增高，提示模型制备成功；②MCT模型大鼠PAs上Rac1、NOX2、NOX4mRNA表达水平显著增高，NOX2、NOX4的蛋白表达水平显著增高；CH模型大鼠PAs上p22phox、p47phox、Rac1、NOX1、NOX2、NOX4、NOXA1mRNA表达水平显著增高，NOX1、NOX4蛋白表达水平显著增高，提示PH模型大鼠PAs上NADPH氧化酶相关基因表达上调；③MCT和CH模型大鼠PASMCs内ROS水平显著增高，提示PH可引起PASMCs内ROS释放增多；④MCT和CH模型大鼠血清及PASMCs内5-HT水平显著增加，5-HT可引起正常大鼠PASMCs内ROS释放，提示在PH模型大鼠PASMCs中5-HT可诱导ROS的释放；⑤在CON大鼠PASMCs中，NOX特异性抑制剂使5-HT引起的ROS释放减少，提示5-HT通过NOX途径诱导ROS的产生。
　　研究结论：①MCT诱导PH模型大鼠PAs中，NOX2、NOX4、Rac1mRNA表达增加，NOX2、NOX4蛋白表达增加；CH诱导PH模型大鼠中NOX1、NOX2、NOX4、NOXA1、Rac1、p47phox、p22phox、NOXO1mRNA表达增加，NOX1、NOX4蛋白表达增加，表明NADPH氧化酶参与PH的发生发展，其中NOX1在CH组作用更显著，NOX2在MCT组作用更显著，NOX4在两种不同PH模型中都发挥重要作用；②不同PH模型大鼠血清与PASMCs中5-HT水平都显著增加，PASMCs内ROS水平较正常组显著增加，而5-HT可以诱导CON组PASMCs内ROS增加，表明PH模型鼠体内ROS增加，可由5-HT引起；③NOX特异性抑制剂使5-HT引起的ROS释放减少，表明5-HT可通过NOX途径发挥对ROS的调控作用，其中NOX4作用最大；④本研究为PH发病机制的研究及防治提供了新的科研思路。

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