肺炎衣原体、人乳头瘤病毒感染与原发性肺癌的关联研究

摘要

目的：
　　探讨肺炎衣原体（Chlamydia peneumoniae，Cpn）、人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染与原发性肺癌的关联。
　　方法：
　　1.采用病例-对照研究设计，面访肺癌新发病例449例和按性别、年龄频数匹配的健康对照512例，通过微量免疫荧光法检测其血清Cpn IgA和IgG感染情况，并用饮食频数表计算饮食风险分数。采用χ2检验、分层分析、非条件Logistic回归模型等方法，计算调整比值比（odd ratio，OR）及其95%可信区间（95%confidence interval，95%CI）。应用叉生分析、Logistic回归模型、Andersson等编制的excel表进行因素间联合作用和交互作用分析。
　　2.选取Cpn血清学抗体均阳性或阴性的原发性肺癌患者各6例，采用高通量芯片技术，对癌和癌旁正常肺组织进行全基因组DNA甲基化与全基因表达联合分析，使用t检验获得癌和癌旁组织间的差异甲基化探针和差异表达基因，并对目的基因进行GO分析和KEGG通路富集分析，探索与Cpn感染相关的潜在功能性异常甲基化基因。对差异甲基化位点进行甲基化水平定量验证，采用t检验或Wilcoxon Rank Sum检验比较分析组间每个DNA片段平均甲基化水平和每个CpG位点的甲基化水平。
　　3.检测140对匹配的肺癌和癌旁正常组织中HPV感染情况。采用病毒高保守L1区PCR扩增和特异探针反向杂交相结合的方法，检测21种临床相关的HPV型别。应用配对χ2检验，分析肺癌与癌旁正常组织HPV检出率差异。应用χ2检验及确切概率法，分析不同性别、年龄、病理类型、临床分期、吸烟和饮酒情况下肺癌组织HPV检出率差异。在肺癌组织HPV阴性组和阳性组中，应用秩和检验分析血液和肺功能指标的分布差异。
　　4.采用系统综述和Meta分析方法，计算机检索PubMed、OVID和Web of science数据库，同时辅以谷歌补遗和文献追溯等途径，收集国内外公开发表的关于HPV感染与肺癌关联的病例对照研究和队列研究文献，检索时限从1990年至2017年2月。由2位评价员按照纳入与排除标准独立筛选文献，进行文献质量评价、提取文献信息，采用Stata13.0软件进行Meta分析。计算合并效应量（OR/RR）及其95%CI，进行亚组分析和Meta回归以探索异质性来源。
　　结果：
　　1.Cpn感染是肺癌的危险因素，调整混杂因素后，血清Cpn IgG抗体阳性者发生肺癌的风险是IgG抗体阴性者的1.37倍（95%CI：0.98-1.92）；血清Cpn IgA抗体阳性者发生肺癌的风险是IgA抗体阴性者的1.65倍（95%CI：1.19-2.30），随着抗体阳性数和抗体滴度的增加，肺癌发病风险增大，呈剂量反应关系（Ptrend＜0.05）。Cpn感染与肺癌中吸烟者、饮酒者、男性的关联更为密切，Cpn感染和吸烟对肺癌有协同作用。沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ctr）和鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci，Cps）感染与肺癌发病风险的关联性无统计学意义。
　　2.饮食是肺癌的影响因素，减少小麦面粉（每周＜3次）、薯类（每周＜1次）、蔬菜（每天＜2次）、水果（每周＜3次）和鱼类（每周＜3次）摄入与肺癌发病风险增加显著相关，依此建立综合饮食风险分数。Cpn IgG和IgA分层结果显示，饮食风险分数越高，肺癌的发病风险越大（Ptrend＜0.05），且Cpn阳性者的饮食风险分数和肺癌发病风险的关联强度高于Cpn阴性者。Cpn感染与饮食风险分数对肺癌存在联合作用和正相加交互作用。
　　3.Cpn相关肺癌的异常甲基化基因（目的基因）共293个，其中最有代表性GO和KEGG富集通路为：神经丝细胞骨架构成和神经丝束组装生物学过程、神经丝细胞组分和肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）通路中的NEFM；转化生长因子β受体同型二聚体复合物细胞组分和转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）信号通路中的TGFBR1；Gs耦合的多巴胺神经递质受体活性和多巴胺神经递质受体活性分子功能中的DRD5；NF-κB诱导激酶活性分子功能中的IKBKE和RIPK3；ALS通路中的PPP3CC和PRPH；TGF-β信号通路中的SMAD6。通过DNA甲基化定量分析验证，仅RIPK3启动子区甲基化程度在Cpn阳性的癌和癌旁组织间差异有统计学意义，而在Cpn阴性癌和癌旁组织间差异无统计学意义。
　　4.140例肺癌和癌旁正常组织中分别检出13和16例HPV阳性，HPV阳性率在肺癌与癌旁正常组织间差异无统计学意义（P=0.607）。在不同人口学和临床病理特征下，肺癌组织HPV检出率无明显差异（P＞0.05）。在肺癌组织HPV阴性组和阳性组中，血小板计数、血小板压积、残气容积、功能残气量和残气容积/肺总量的分布有差异（P＜0.05）。
　　5.Meta分析最终纳入37篇文献，36篇病例对照研究，合计6980例病例，7474例对照；1篇队列研究，合计24162例HPV感染者；1026986例非HPV感染者。采用随机效应模型分析，结果显示HPV感染与肺癌发病风险关联的合并OR值为3.64（95%CI：2.60-5.08）。异体病例对照研究、自身病例对照研究和巢式病例对照研究的合并OR值及95%CI分别为6.71（4.07-11.07）、2.59（1.43-4.69）和0.92（0.63-1.36）。HPV-16和HPV-18的合并OR值及95%CI分别为3.14（2.07-4.76）和2.25（1.49-3.40）。HPV感染可能与肺鳞状细胞癌、腺癌和小细胞癌有关。亚组分析发现可能的异质性来源有：研究类型、性别、吸烟、HPV检测方法、HPV亚型、病理类型、病理分期和组织分化程度。
　　结论：
　　1.慢性Cpn感染是肺癌的危险因素（尤其是有吸烟和饮酒史的男性），与血清Cpn IgG相比，IgA与肺癌的关联更密切，且两种抗体联合检测对肺癌发病风险的预测效果更好。肺部感染及时就医治疗及富含小麦面粉、薯类、蔬菜、水果和鱼类的饮食模式可能对肺癌的防制有公共卫生学意义。
　　2.血清Cpn阳性肺癌组织中特有的异常甲基化基因RIPK3，通过其启动子区低甲基化，使RIPK3高表达，可能在调节细胞程序性坏死和激活NF-κB转录因子中起关键作用，参与肺癌的发生发展。
　　3.在福建人群中，尚未发现HPV感染与原发性肺癌发生风险有明显关联，HPV感染可能通过引起支气管上皮湿疣性病变，从而影响肺的残气功能。
　　4.HPV阳性者发生肺癌的危险性是HPV阴性者的3.64倍，尤其是HPV-16和HPV-18型感染者肺癌发生风险高。未来的研究需要关注HPV疫苗是否能有效降低肺癌的发病率。

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