磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)对肝细胞癌生长及侵袭的影响

摘要

目的：
　　肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌，占肝癌的90%，有数据表明：HCC由于其发病率逐年增加且预后差现位居世界恶性肿瘤致死病因的第2位。
　　GPC-3是过度生长综合症(Simpson Golabi BehmelSyndrome,SGBS)患者中普遍存在的功能突变基因，是蛋白聚糖家族成员之一。GPC-3基因编码的GPC-3蛋白可通过共受体(co-receptor)与相关配基如生长因子、细胞黏附分子等共同作用，来参与细胞生物学行为的调节。有学者认为在细胞生长的各个过程包括细胞的繁殖、黏附、分化、迁移等过程中均存在GPC-3的直接或间接调控。研究发现HCC患者体内的GPC-3表达水平跟健康人及良性肝疾病患者相比显著升高，正常成人及良性肝疾病患者组织和血清中的GPC-3表达水平极低甚至检测不到，这表明GPC-3与HCC关系密切，可能在其发生发展中起促进作用。
　　GPC-3是HCC临床鉴别诊断中有用的特异性标志物，又是HCC预防和免疫治疗的新靶点，尽管目前有多篇文章探讨其分子机制，它的结构已基本研究清楚，但是其功能尚未完全阐明。基于以上研究背景，本课题通过Crispr/cas9技术对GPC-3进行敲除并构建了GPC-3过表达载体，沉默和上调HCC细胞中GPC-3基因的表达，进而研究GPC-3对于肝癌的生长、侵袭等生物学行为的影响，为进一步阐明GPC-3在HCC中的作用机制，指导HCC的临床治疗奠定基础。
　　方法：
　　1、通过Western-blot和Q-PCR检测多株HCC细胞中GPC-3蛋白/基因的表达水平，选择GPC-3高表达和低表达的HCC细胞株；
　　2、按照Genebank（NCBI）中GPC-3基因序列设计引物，PCR扩增、纯化以获取GPC-3目的片段，经基因重组及双酶切来构建GPC-3过表达载体；
　　3、运用Crispr/cas9技术设计三条靶向GPC-3基因的gRNA，插入Crispr/cas9敲除载体后导入高表达GPC-3的细胞株，筛选出一条编辑效率最高的gRNA；
　　4、将上述GPC-3过表达载体及GPC-3敲除载体用第三代慢病毒包装系统分别进行慢病毒载体包装，浓缩细胞上清液后获得相应的病毒液；
　　5、用上述含有GPC-3过表达载体的慢病毒液感染低表达GPC-3的HCC细胞，用含有GPC-3敲除载体的慢病毒液感染高表达GPC-3的HCC细胞，通过嘌呤霉素（puro）持续药筛获得GPC-3过表达稳定细胞株以及不表达GPC-3的单克隆细胞株，用Western-blot和Q-PCR技术检测细胞中GPC-3的表达情况；
　　6、通过CCK-8、划痕实验、Transwell及流式细胞仪分别检测细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡情况，观察GPC-3过表达/敲除后细胞的生物学行为的改变趋势；
　　7、观察敲除GPC-3后Huh-7细胞的裸鼠皮下移植瘤模型的生长情况，判断GPC-3敲除细胞株的体内成瘤能力。
　　结果：
　　1、多株HCC细胞中GPC-3基因表达水平从高到低的顺序为：HepG2＞Hep3B＞Huh-7＞LM3＞MHCC97H＞MHCC97L，SK-hep-1几乎不表达GPC-3；
　　2、Western-blot检测HCC细胞的GPC-3蛋白表达水平，HepG2、Hep3B、Huh-7三株细胞高表达GPC-3，LM3、MHCC97H、MHCC97L、SK-hep-1四株细胞未检测到明显GPC-3条带；
　　3、成功构建GPC-3过表达慢病毒载体，获得三个GPC-3完全敲除的病毒载体；
　　4、选择MHCC97L、SK-hep-1两株细胞用于过表达GPC-3，Huh-7细胞用于敲除GPC-3，获得GPC-3过表达的稳转细胞株及敲除的单克隆细胞株。通过Western-blot和Q-PCR证实各株细胞成功过表达/敲除GPC-3；
　　5、过表达GPC-3后，SK-hep-1细胞的增殖能力被抑制，而MHCC97L细胞的增殖能力不受影响，敲除GPC-3后，Huh-7细胞的增殖能力明显降低；
　　6、过表达GPC-3后，与对照组相比，MHCC97L、SK-hep-1细胞的迁移/侵袭能力均增强，而敲除GPC-3的Huh-7细胞的迁移及侵袭能力明显低于对照组；
　　7、过表达/敲除GPC-3后，MHCC97L、SK-hep-1、Huh-7三株细胞的凋亡情况与对照组相比均没有明显差异；
　　8、裸鼠成瘤实验发现敲除GPC-3组Huh-7细胞在裸鼠体内成瘤能力低于对照组。
　　结论：
　　成功构建GPC-3过表达/敲除载体，并获得稳定过表达/敲除GPC-3的HCC细胞株。通过体内外实验发现GPC-3能促进HCC细胞的迁移、侵袭，但对HCC细胞体外增殖的影响因细胞系的不同而不同，GPC-3与肝癌细胞的凋亡无密切相关。以上结果提示通过抑制HCC患者体内GPC-3的表达可作为治疗HCC的有效手段。

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