hBMP-7的定点突变及其在甲醇酵母中的表达鉴定

摘要

骨形态发生蛋白(Bone Morphogenesis Proteins,BMPs)是一类蛋白质生长因子,在动物(包括人类)的生长发育过程中对组织器官的决定与分化起重要作用.骨形态发生蛋白-7(BMP7)又称成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1,OP-1)具有促使细胞组织分化形成骨组织的作用.该研究尝试建立hBMP7成熟片段在毕赤酵母(Pichiapastoris)中的表达技术.主要研究工作包括:将hBMP7全长cDNA的成熟片段克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上,构建能表达hBMP7成熟肽的载体质粒;以这一表达载体为基础,依据酵母密码子使用偏好性,将hBMP7成熟片段内3个酵母使用频率为O的精氨酸密码子突变为使用频率较高的同义密码子AGA,以期实现高效表达;表达质粒经转化酵母宿主菌株KM71,PCR鉴定基因整合后,摇瓶培养,甲醇诱导表达并用点杂交快速筛选高表达菌株.摇瓶表达上清经Tricine-PAGE分析表明在18KD处有一新增条带;Western-Blotting表明该条带具有良好的抗原性和特异性,证实为hBMP7,重组产物的理论分子量为15.6KD,实际值为18KD,推测产物带有一定程度的糖基化修饰,重组产物以单体形式存在,没有检测到预期的二聚体形式.利用蛋白质Bradford总蛋白定量,结合Glyko BandScan量化软件的分析发现,表达上清中特异性蛋白的表达量可达到25.45μg/ml,占总蛋白含量的76.2％;密码子优化使rhBMP7摇瓶培养表达量较未优化序列提高了4~5倍;对不同诱导条件的观察表明:诱导5d表达量达到最高水平;保持以终浓度为1%的甲醇进行诱导得到最高表达量;调整诱导前菌体生物量在10左右,蛋白的表达量最为理想.通过经典的小鼠股部肌袋包埋实验,初步证明毕赤酵母分泌表达的rhBMP7成熟片段能够诱导间充质干细胞(MSC)分化为软骨细胞.

目录

文摘

英文文摘

致谢

前言

文献回顾

第一部分：BMPs的研究概况

第二部分：毕赤酵母真核表达系统的优化策略

本研究的目的和意义

实验内容

第一部分：hBMP7毕赤酵母表达载体的构建及成熟片的定点突变

第二部分：hBMP7成熟片段在毕赤酵母中的表达及鉴定

第三部分：rhBMP7的生物活性研究

结论

参考文献

AppendixI:

sequecece of expression plamid ppic9k-hBNP7/mut