一个水稻开颖不育突变体ohs1(t)的遗传分析与精细定位

摘要

花是高等植物最重要的器官之一。显花植物生殖时期最显著的特征就花的发育。花的发育过程不单是植物繁殖后代和种群扩增的基础，而且是植物生命的继续的根本保证；同时是生产和作物的生产能力以及作物的产量也由它直接决定。因此，生物学家极其关注与重视植物花器官的形成和发育。上世纪八十年代以来，研究人员利用不断发展的分子遗传学与分子生物学技术，取得了许许多多的科研成果，成为发育生物学研究中最引人入胜的热点[1]。 作为单子叶模式植物的禾本科水稻，它的花的发育过程及其结果能直接影响到稻米品质与稻谷产量，因此研究水稻花器官的形态建成具有非常重要的经济价值与理论意义。研究人员已经完成了对水稻全基因组的测序工作，已将发现的突变体应用于研究控制水稻生理性状和形态和基因连锁分析以及基因的定位和克隆。1998年，国际水稻遗传协会报告的突变体基因已定位的有571个。尽管全世界已在水稻上分离了40万条EST与3万条cDNA，但是许多的水稻突变体材料还没分类以及大多数特已性状基因还没有分离到。研究人员利用不断发展的克隆技术与测序完成的水稻全基因组，越来越注重有关有益基因的定位和克隆和转移以及累加等方面的研究。克隆基因技术随着分子生物学方法的发展也不断的对其方法也不断进行革新，现在应用比较广泛的主要有减法杂交PCR克隆和mRNA差异显示扩增和表型克隆和图位克隆以及转座子标记法等这几种。在对这些方法进行具体选择时，主要要看材料的性质特点以及研究的目的。本文报道了一个水稻开颖不育突变体的形态表型、遗传规律及基因定位研究结果，为该突变体基因的进一步克隆及功能研究奠定基础。 本课题组在明恢86的转基因后代中发现了一个水稻花器官发育突变体，暂命名为开颖不育突变体(open hull sterile 1 (ohs1(t))。ohs1(t)突变体表现颖花开裂，内外稃片变细，内稃微弯向外稃，有雌雄蕊分化，但雌雄蕊较野生型株的小，大多数花药没有花粉，少数花药中含有不育花粉，雌雄配子均不育。转基因标记基因分析表明ohs1(t)不是一个T-DNA插入的突变体。本研究首先ohs1(t)分别与明恢86、R527、93-11和中花16号杂交后代遗传分析表明ohs1(t)是一个隐性基因控制的突变体。然后以ohs1(t)和93-11杂交F2群体中突变个体作为初步定位群体，按照图位克隆的方法，利用分子标记对该基因进行逐步定位，并用生物信息学的方法对最终的定位区间内的候选基因的进行分析与预测。主要的研究结果如下： 1.OHS1(t)基因的遗传分析。由于ohs1(t)突变体的花器官发生变异而高度不育，因此ohs1(t)突变位点只能由杂合体保持。用ohs1(t)群体中的野生型植株分别与明恢86、R527正反交，与9311、中花16杂交，F1代均没有突变表型。F2群体田间调查发现：将ohs1(t)突变体置于不一样的遗传背景下进行研究，对F2群体中的突变体植株和野生型植株分离比做卡方检测，发现F2群体中的两者的分离比尽管均有些偏离3:1的分离规律，但与15:1以及其它比例分离规律不符合。尽管ohs1(t)突变体的后代分离规律不完全符合孟德尔分离规律，但从趋势上看，F2后代分离比符合或更接近符合孟德尔单基因的遗传规律，推测ohs1(t)是一单隐性基因控制的突变体。 2.构建93-11与ohs1(t)的F2代定位群体，运用BSA法，通过筛选88对基本均匀分布于12条染色体上的，且在93-11/ohs1(t)之间有多态性的SSR分子标记，在1号染色体上找到两个标记RM493与RM5638与ohs1(t)发生共分离，并且将目的基因OHS1(t)夹在这两个标记的之间，根据这两个标记对119株突变个体进行分析，从而将该基因初步定位在1号染色体长臂上。 3.开发新的SSR标记，将OHS1(t)基因定位在RM493和NSSR0107之间，遗传距离分别为7.8cM和1.3cM。 4.由于在亲本93-11与ohs1(t)之间无法再找到更近的且在两亲本间有多态的分子标记，所以采取换群体的方法，即用粳稻中花16号与ohs1(t)杂交F2代分离群体454株突变个体做进一步精细定位。 5.用新开发的SSR标记，对中花16号与ohs1(t)的杂交的F2群体(454个突变单株)进行分析，将OHS1(t)基因进一步精细定位在NSSR0115和RM493之间，两标记与OHS1(t)的遗传距离分别为0.2和7.8 cM。 6.开发设计InDel标记，并找到一个距离OHS1(t)更近的标记InDe10102，结果最终将OHS1(t)精细定位在InDel标记NSSR0115和InDe10102之间的区域，两标记与OHS1(t)的遗传距离分别为0.2和0.3 cM。根据第1号染色体的物理图谱看，这两个标记间还有2个BAC/PAC，物理距离约66kb。 7.通过NCBI网站及其他一些相关网站和数据库资源，对这个精细定位的区间内的所有基因进行生物信息学分析及功能预测，为下一步确定候选基因及其表达分析和功能互补实验做准备

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

1课题背景

2文献综述

2.1植物花器官发育的研究进展

2.2模式植物花发育基因研究进展

2.3植物基因分离策略与定位方法

2.4分子标记

第1章OHS1(t)的遗传分析与分子标记定位

第一节前言

第二节材料与方法

1供试材料

2群体的构建

3种植

4调查及统计分析

5所用引物

6水稻DNA的提取和DNA池的构建

7定位群体

8PCR反应

9非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

10脂糖凝胶电泳

11传做图和基因定位

第三节结果与分析

1 ohsl(t)突变体的表型和遗传分析

2 OHSl(t)基因的分子标记定位

3对OHSl(t)基因的定位结果的总结

第四节讨论

第2章结论

附录

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历