甘蔗内生固氮菌的分离鉴定及16SrRNA基因克隆和序列分析

摘要

本文首先用无氮培养基从福州甘蔗栽培品种的根部进行内生固氮菌的分离、纯化和筛选，并采用乙炔还原法对这些菌株进行固氮酶活性测定；其次对分离出的菌株进行生理生化指标测定和16S rRNA基因克隆和序列分析；同时研究了在不同环境因子作用下少动鞘氨醇单胞菌的生长特性；最后，采用三亲交配法将mifH-gfp融合荧光蛋白标记基因导入固氮菌少动鞘氨醇单胞菌，将其回接到甘蔗中，利用激光共聚焦扫描显微镜对其进行了观察。 研究结果表明：实验分离到了12株形态大小、质地各异的菌株；固氮酶活性测定结果显示6株固氮酶活性较高，其中少动鞘氨醇单胞菌固氮酶活性为最高；在对12株菌16S rRNA基因的序列分析的基础上，建立了系统发育树，确定了菌株分类学地位及进化亲缘关系；在不同环境因子作用下，少动鞘氨醇单胞菌在生长时对这些处理有较广的适应性，对温度和pH的适应范围较大，在15-40℃，pH4.5-9.0范围内均能生长，并且具有很强的耐铵能力，而且对高渗透压环境也有很强的适应性；显微观察表明固氮菌主要定殖在甘蔗根的内皮层细胞，回接结果显示接种少动鞘氨醇单胞菌的甘蔗苗与未接菌的对照相比，株高提高了87.19％，鲜重增加了119.88％。甘蔗是热带、亚热带禾本科C4植物，是主要的制糖原料，也可以用它生产工业酒精。世界上甘蔗种植面积最大的国家是巴西，其次是印度，中国位居第三，在中国主要分布在广西、广东、福建、台湾、四川、云南、江西、贵州、浙江、湖南、湖北等省份。 氮元素是空气中的主要成分之一，游离型的氮气不能被大多数生物直接利用，必须还原成氨类化合物才能被生物所利用，在这个生化反应过程中生物固氮发挥了重要作用。生物固氮占地球上固氮总量的90％，对维持地球生态平衡有着重要意义。除了豆科植物，目前在甘蔗、玉米等作物上也发现了有固氮微生物存在。利用固氮生物的自生固氮能力进行固氮，不仅提高固氮效率，而且可以节省大量能源。甘蔗是南方地区的经济作物，种植面积非常大。对生物固氮进行研究，对于缓解能源短缺和解决农业生产中造成的环境污染等问题，具有重要意义。如果能在甘蔗体内分离出固氮能力强的固氮菌，并对其进行研究，构建出工程菌株，对于解决当前农业生产的实际问题开辟了一个新的途径。 国内外学者在内生固氮菌的研究中，已经取得了很多有意义的进展。1986年Barbara从卡拉草内分离到了固氮弧菌(Azoarcus sp.)，可用于牧草生产中；1987年巴西Dobereiner实验室从甘蔗体内分离到醋酸固氮菌(Acetobacter iazotrophicus)，该菌株具有非常高的固氮能力，可以提供甘蔗生产中五分之三的氮元素；我国学者在水稻和玉米内生固氮菌的研究中，做了大量工作，1981年丘元盛等从广东水稻根中分离出粪产碱菌和阴沟杆菌，尤崇杓对它们的生理特性及其与水稻的相互作用开展了深入研究，采用分子生物学方法构建了水稻固氮工程菌株。 前人的研究工作给我们很多重要启示，我们从福州本地现有主要甘蔗栽培品种的根部进行固氮菌的分离，纯化得到12株形态大小质地各异的菌种，用乙炔还原法测定菌种固氮酶活性，获得6株酶活较高的菌株。对分离出的菌株进行生理生化指标初步鉴定；用分子生物学技术对这些细菌的16S rRNA基因进行克隆，并对基因序列进行了分析，建立了系统发育树，在进化上确立了菌株间的亲缘关系。16S rRNA基因序列分析结果与生物梅里埃公司WIPEK32鉴定仪生理生化测定结果以及形态学观察的结果一致，且经判定这些菌株均是属于固氮菌属。将12株菌的16S rRNA基因序列提交到Genbank数据库，获得了序列号：EU931548、EU931549、EU931551、EU931552、EU931553、EU931555、EU931557、EU931559、EU931560、EU931561、EU931563、EU931564。从甘蔗根部分离鉴定到了10个种属的固氮菌：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、短芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(klebsiella pneumonias sp.Pneumoniae)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、少动鞘鹌鹑单胞菌(Aphingomonas paucimobilis)。 我们还对温度、酸碱度、铵盐浓度、蔗糖浓度、渗透压等不同环境因子处理下固氮菌的生长特性进行了研究。研究结果表明在无氮源的条件下，少动鞘氨醇单胞菌对环境因子都有较广的适应性，对温度和pH的适应范围较大，在15-40℃，pH4.5-9.0范围内均能生长，且具有很强的耐铵能力，对高渗透压环境都有很强的适应性。 基于少动鞘氨醇单胞菌对不同环境条件表现出的广泛适应性，采用三亲交配法将，nifH-gfp标记基因导入少动鞘氨醇单胞菌中，用该固氮菌回接甘蔗植株，对感染细菌的甘蔗根进行激光共聚焦扫描显微镜观察，发现少动鞘氨醇单胞菌主要分布在蔗根内皮层细胞。回接结果显示接种少动鞘氨醇单胞菌的甘蔗组织培养苗与未接菌的对照相比，从植株的鲜重来看，接种菌后其甘蔗组培苗的鲜重要较对照组要高119.88％，实验组植株鲜重与对照组呈极显著性差异，其P=0.007<0.01，由此说明，接种菌液对植株的鲜重具有极显著性的影响。而从植株的株高来看，接种菌后其甘蔗组培苗的株高要较对照组要高87.19％，实验组植株株高与对照组相比呈显著性差异，其P=0.023<0.05，由此说明，接种菌液对植株的株高具有显著性的影响。此外，接菌盆栽苗42天后，对照组株高平均增加量为11.27cm，而实验组平均增加高度为27.5cm，其P=0.025<0.05，对照组与实验组之间差异显著，说明固氮菌对甘蔗苗生长具有促进作用，这与接菌对甘蔗组培苗的影响结果相一致。由于时间的限制，对接种固氮菌后盆栽苗长势的研究只是阶段性和初步的，还需要进一步的实验加以证实。这些结果将为固氮微生物在农业生产上的应用研究提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

绪论

第1章甘蔗内生固氮菌分离纯化和初步鉴定

1.1实验材料

1.1.1材料

1.1.2培养基

1.1.3实验试剂

1.1.4主要仪器

1.2方法与步骤

1.2.1固氮细菌的分离纯化

1.2.2固氮酶活性的测定

1.2.3固氮菌的生理生化特性

1.2.4固氮菌的初步鉴定与保存

1.3结果与讨论

1.3.1固氮细菌的分离纯化筛选

1.3.2固氮菌酶活检测结果

1.3.3固氮菌的初步鉴定

1.3.4菌种生理生化初步鉴定结果

1.4本章小结

第2章固氮菌16S rRNA基因克隆及系统发育分析

2.1实验材料

2.1.1菌株

2.1.2主要工具酶和试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4溶液配制(主要参考分子克隆实验指南第三版)

2.2方法与步骤

2.2.1细菌基因组DNA的提取

2.2.2 16Sr RNA基因的PCR扩增

2.2.3目的基因片段的回收与序列测定

2.2.4系统发育树的构建

2.3结果与讨论

2.3.1 16S rRNA基因的PCR扩增结果

2.3.2 16S rRNA序列同源性分析

2.3.3 16SrRNA序列的系统发育分析

2.4本章小结

第3章影响固氮菌生长的环境因子效应试验

3.1实验材料

3.1.1菌株

3.1.2培养基

3.1.3实验试剂

3.1.4主要仪器

3.2方法与步骤

3.2.1固氮菌株生长曲线测定

3.2.2不同温度对菌株生长的影响

3.2.3不同pH对菌株生长的影响

3.2.4不同渗透压对菌株生长的影响

3.2.5不同蔗糖浓度对菌株生长的影响

3.2.6不同氯化铵和硝酸钾浓度对菌株生长的影响

3.3结果与讨论

3.3.1菌株SK在不加氮源培养条件下的生长曲线

3.3.2 pH和温度对菌株SK生长的影响

3.3.3不同氯化钠浓度对菌株SK生长的影响

3.3.4不同蔗糖浓度对菌株SK生长的影响

3.3.5不同铵浓度对菌株SK生长的影响

3.4本章小结

第4章 回接固氮菌对甘蔗生长的影响

4.1实验材料

4.1.1供试材料

4.1.2甘蔗组织培养基

4.1.3主要仪器

4.1.4生化试剂

4.2方法与步骤

4.2.1固氮菌的抗性敏感性试验

4.2.2三亲交配法转化少动鞘氨醇单胞菌

4.2.3回接甘蔗组织培养苗验证

4.2.4甘蔗根部共聚焦显微切片观察

4.2.5固氮菌再分离

4.2.6回接盆栽试验苗

4.3结果与讨论

4.3.1三亲交配法转化结果

4.3.2少动鞘氨醇单胞菌在甘蔗根中的分布

4.3.3接种固氮菌后组织培养苗的长势

4.3.4固氮菌的再分离及其鉴定

4.3.5接种固氮菌后盆栽苗的长势

4.4本章小结

第5章结论

附录

参考文献

读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历