裂殖壶菌Schizochytrium sp.FJU-512在温度胁迫下的差异蛋白质组学研究

摘要

温度是影响细胞生长、细胞内脂肪酸种类组成和含量的重要因素之一。改变膜脂中不饱和脂肪酸的比例是生物耐受低温胁迫的重要机制之一。生物在低温胁迫下，通常会提高细胞内各类生物膜中不饱和脂肪酸的含量或增加支链脂肪酸的比例，来增强膜的流动性，从而保证膜的物质运输、能量转换、信息代谢和代谢调节等生理过程的正常进行。多篇文献报道，多种生物的脱饱和酶（多不饱和脂肪酸合成的经典途径中的一类重要酶类）都是明显的温度敏感因子。
　　 裂殖壶菌Schizochytrium是一类低等的海洋真菌，具有培养简单、生长速度快，脂肪酸组成简单易纯化等特点，是发酵生产二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA）的理想菌种。
　　 通过摇瓶发酵、酸热法提取油脂与GC-MS检测分析，发现培养温度是影响裂殖壶菌的生物量，油脂含量以及脂肪酸组成的重要环境因素。Schizochytrium.sp FJU-512在15℃-37℃间均能生长。在15℃下，虽然DHA含量超过60％，但是生物量和油脂得率远不及其它温度。20℃-30℃菌生长较好，油脂含量较高且DHA含量相对稳定。当温度升到37℃，生物量、油脂含量以及DHA含量均下降了。饱和脂肪酸总量在37℃含量最高，15℃最低，在20℃-30℃间维持恒定；不饱和脂肪酸总量在15℃含量最高，37℃最低，在20℃-30℃间维持恒定。
　　 首次运用差异蛋白质组学研究温度对Schizochytrium调控的分子机理，有助于深入了解Schizochytrium的油脂代谢。通过摸索适宜的样品制备方法及双向电泳条件，成功建立适合分离裂殖壶菌可溶性蛋白的双向电泳体系。最终确立玻璃珠破碎法结合TCA/丙酮沉淀除盐处理的方法为裂殖壶菌可溶性蛋白提取方法，采用pH3-10（24cm）的IPG胶条进行双向电泳，以满足二维电泳分析的需要，同时为质谱鉴定奠定基础。
　　 选取DHA产量显著差异的三种生长温度，即低温胁迫（15℃）、适宜温度（28℃）及高温胁迫（37℃），对裂殖壶菌于不同温度刺激的蛋白质组图谱比较分析；选取差异点进行质谱分析，鉴定出8个温度敏感因子。温度对菌的影响非常广，这些变化显著的蛋白都跟糖酵解，激酶活性，电子链的传递，氨基酸代谢，活性氧自由基的清除，氧化磷酸化，核酸与蛋白质合成，能量代谢等有关。大部分蛋白涉及能量代谢，主要是糖酵解，说明初级代谢为裂殖壶菌在温度胁迫下建立新的动态平衡来适应低温。
　　 实时荧光定量PCR技术检测温度胁迫下裂殖壶菌超氧化物歧化酶、热激蛋白、细胞色素b5三个温度敏感相关基因表达水平的差异，从mRNA水平的角度验证了蛋白质组质谱结果的正确性。另外，从生物信息学角度分析了裂殖壶菌超氧化物歧化酶蛋白序列。
　　 初步探讨温度敏感因子对菌的能量转换、物质运输、信息代谢等生理过程的影响，发掘其与DHA等高度不饱和脂肪酸生物合成的关联，同时在分子水平上揭示裂殖壶菌温度适应机制。

目录

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第1章 绪论

1.1 DHA产生菌Schizochytrium sp.FJU-512背景介绍

1.2 温度对高度不饱和脂肪酸合成的重要性

1.2.1 高度不饱和脂肪酸概况

1.2.2 DHA的研究概况

1.2.3 温度对高度不饱和脂肪酸的影响

1.3 比较蛋白质组学及其研究技术

1.3.1 比较蛋白质组学的研究内容

1.3.2 比较蛋白质组学的研究技术

1.4 本课题的研究目的和意义

第2章 温度对裂殖壶菌FJU-512生长及脂肪酸组成的影响

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株

2.2.2 培养基

2.2.3 主要仪器

2.3 培养方法

2.3.1 单菌落分离平板培养

2.3.2 种子培养

2.3.3 摇瓶发酵培养

2.4 裂殖壶菌的生物量、总脂含量及脂肪酸组成的测定

2.4.1 生物量测定

2.4.2 总脂含量测定

2.4.3 脂肪酸组成的测定

2.5 结果与分析

2.5.1 裂殖壶菌生物量和总脂含量测定

2.5.2 裂殖壶菌脂肪酸组成菌测定

2.6 小结与讨论

第3章 裂殖壶菌FJU-512可溶性蛋白的提取及双向电泳方法的建立

3.1 前言

3.2 材料

3.2.1 材料菌株及培养基

3.2.2 重要试剂配制

3.2.3 主要仪器

3.3 裂殖壶菌FJU-512上清蛋白的提取和处理

3.3.1 玻璃珠破碎法

3.3.2 苯酚抽提法

3.3.3 超声波破碎法

3.3.4 TCA沉淀法对提取蛋白质进行除盐处理

3.3.5 TCA/丙酮沉淀法对提取蛋白质进行除盐处理

3.4 裂殖壶菌的双向电泳

3.4.1 Bradford法蛋白定量

3.4.2 上清蛋白的比较选择

3.4.3 双向电泳

3.5 结果与分析

3.5.1 Bradford法蛋白定量

3.5.2 裂殖壶菌FJU-512上清蛋白的提取和处理

3.5.3 IPG胶条pH范围的选择

3.5.4 IPG胶条长度的选择

3.6 小结与讨论

第4章 温度对裂殖壶菌FJU-512可溶性蛋白质表达差异的研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株及其培养

4.2.2 三种温度培养的裂殖壶菌FJU-512可溶性蛋白质双向电泳

4.2.3 质谱鉴定

4.3 结果与分析

4.3.1 裂殖壶菌FJU-512不同温度发酵的差异蛋白质组学

4.3.2 质谱结果分析

4.4 小结与讨论

第5章 实时荧光定量PCR技术检测裂殖壶菌FJu-512温度敏感因子mRNA的表达

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌株及其培养

5.2.2 主要试剂与仪器

5.2.3 三种温度培养的裂殖壶菌RNA的提取

5.2.4 反转录反应与PCR扩增

5.2.5 裂殖壶菌SOD的生物信息学分析

5.3 结果与分析

5.3.1 RNA提取

5.3.2 荧光定量分析

5.3.3 SOD基因的生物信息学分析

5.4 小结与讨论

结论

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历