西双版纳热带雨林土壤微生物群落结构多样性及其木质素降解酶相关基因资源的宏基因组学研究

摘要

木质纤维素是地球上储量最为丰富的可再生有机碳源，开发以木质纤维类原料替代粮食资源的燃料乙醇技术，是未来解决燃料乙醇原料成本高、原料有限的根本出路。本文利用分子生态学技术研究土壤木质纤维素降解过程中微生物群落结构及其动态演化规律，挖掘不同阶段的优势菌群，探索未来木质纤维素商品化利用的新策略。以西双版纳地区热带雨林土壤为研究对象，以提取的土壤总基因组DNA为模板，分别PCR扩增细菌的16S rRNA基因和真菌的18S rRNA基因，构建16S rRNA及18S rRNA基因文库，并进行了PCR-RFLP分析。通过对75个不同RFLP带型所代表的细菌克隆和26个不同RFLP带型所代表的真菌克隆进行了测序、分析以及系统发育进化树构建，分别分析了该土壤中的细菌和真菌群落结构。结果表明，西双版纳地区热带雨林土壤主要的细菌菌群为Acidobacteria、Proteobacteria、Actinobacteria和一个未分类的细菌类群。其中Acidobacteria是细菌菌群的绝对优势菌群，占总克隆数的89.4％，包含Gp1、Gp2、Gp3和Gp5四个大簇。而真菌菌落大致可以分为三大菌群：Fungi incertae sedis、Ascomycota和Basidiomycota。Fungiincertae sedis是第一大类群，占63.0％，包括Mucoromycotina和unclassifiedZgomycetes两大亚类群。Ascomycota次之，占总克隆数的32.4％，而Basidiomycota在此克隆文库当中检出比例仅占克隆总数的4.6％。从已鉴别的微生物类群中，大多数真菌类群，如Basidiomycota门的Cryptococcus和Panaeolus；Ascomycota门的Tricladium、Aspergillus、Penicillium和Neurospora菌属等都被报道具有木质纤维素分解能力。
　　 参与土壤中木质纤维素生物降解的微生物类群不仅具有多样性，而且降解过程按一定的次序进行，参与的微生物类群显示出明显的演替规律。以天然木质纤维素为主要培养基质，分别选取培养8天和15天的土样再次构建真菌的18S rRNA基因文库。随机挑取克隆子进行PCR-RFLP带型分析，并与先前的带型结果进行对比，统计带型比例的变化，并对新的带型（培养8天出现16个新带型、15天出现11个新带型）对应的克隆测序分析。结果表明，培养的不同阶段真菌群落结构不断变化，其优势菌群也随之变化。最初，以子囊菌类营腐生的污染性机会菌数量和种类为主，随着培养时间的延长，子囊菌类逐渐减少，而担子菌类木腐菌的数量和种类逐渐增多并最终占主要优势。
　　 微生物对木质纤维素的降解主要通过分泌一系列的酶系来完成。担子菌在整个降解过程中分布具有持续的连贯性，并且它是土壤中的主要木腐菌类。我们以担子菌的木质素降解酶基因作为主要考察指标，进一步从酶基因水平追踪和解释微生物降解木质纤维素的演替变化规律。根据已公布的担子菌漆酶基因保守序列设计特异引物，以提取的土壤基因组总DNA为模板，PCR扩增了140 bp的担子菌种群漆酶基因铜离子结合保守区与序列。用地高辛标记此段序列作为探针，通过菌落原位杂交从已构建的西双版纳土壤宏基因组文库中筛选含有该漆酶基因片段的阳性克隆子。通过筛选大约30000个宏基因组克隆，最终一共获得了六个有杂交信号的克隆子。对其中的一个阳性克隆子进行亚克隆并测序，获得的测序结果与Gluconolactonase具有较高的同源性。Gluconolactonase和漆酶同属于氧化酶家族，因此可能参与了木质素的氧化过程。继续对阳性克隆子进行分析，获得理想的漆酶基因并进行标记追踪将为研究土壤木质纤维降解微生物在土壤中的行为提供最为直接的证据。

目录

文摘

英文文摘

中文文摘

第一章 绪论

第一节 木质纤维素

1.1 木质纤维素的结构和组成

1.2 木质纤维素的在工农业生产中的应用

1.3 木质纤维素在生产应用中存在的问题

第二节 木质纤维素的生物降解

2.1 降解纤维素的微生物

2.2 纤维素酶

2.3 降解木质素的微生物

2.4 降解木质素的酶类

第三节 木质纤维素降解过程中菌群结构的演替研究

3.1 木质纤维降解过程中的菌群演替

3.2 研究木质纤维降解过程中菌群演替策略

第四节 本课题的研究内容与意义

4.1 课题研究内容

4.2 课题研究的目的与意义

第二章西 双版纳地区热带雨林土壤微生物群落结构的分析

第一节 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

第二节 结果与分析

2.1 土壤样品的基本理化特性

2.2 土壤基因组总DNA的提取

2.3 细菌16S rDNA片段的扩增

2.4 真菌18S rDNA片段的扩增

2.5 rRNA基因克隆文库的构建

2.6 rRNA基因克隆文库的随机验证

2.7 rRNA基因克隆文库的PCR-RFLP分析

2.8 rRNA基因的测序和文库多样性分析

2.9 序列分析和系统发育进化树的构建

2.10 微生物的菌群结构和多样性分析

第三节 小结与讨论

第三章 西双版纳雨林土壤真菌群落在木质纤维素降解过程中的动态分析

第一节 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

第二节 结果与分析

2.1 富集土样的基本理化性质

2.2 富集土样的18S rRNA基因扩增

2.3 富集土样18S rRNA基因克隆文库的PCR-RFLP分析

2.4 富集土样18S rDNA序列的测序和文库多样性分析

2.5 序列分析和系统发育进化树的构建

2.6 富集培养土样的真菌群落的系统发育分析

2.7 木质纤维素降解过程中真菌群落结构的分析比较及演替变化

第三节 小结与讨论

第四章 木质纤维素降解过程中担子菌种群漆酶基因的研究及宏基因组学筛选

第一节 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

第二节 结果和分析

2.1 真菌漆酶基因的PCR扩增

2.2 质粒抽提和双酶切筛选阳性克隆

2.3 漆酶基因的测序与分析

2.4 漆酶基因部分片段PCR扩增与回收

2.5 探针标记效率的检测

2.6 土壤基因组的杂交分析

2.7 西双版纳地区热带雨林土壤担子菌种群漆酶基因的宏基因组学筛选

2.8 阳性克隆子的测序与分析

第三节 小结与讨论

结论

参考文献

攻读学位期间承担的科研任务与主要成果

致谢

个人简历