西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究

摘要

本文采用流式细胞术和显微术的方法,研究流式细胞术用于评价西施舌(Coelomactra antiquata)精子质量的可行性、西施舌精子的超低温冷冻保存技术以及冷冻损伤机制,旨在建立一套成熟的西施舌精子超低温冷冻保存技术,为西施舌的人工育苗和遗传育种等研究提供科学依据和技术支持。主要研究结果如下:
　　 采用伊红拒染法和PI拒染法,借助光学显微镜和流式细胞仪进行两种方法的相关性研究和精密性比较,从而探讨流式细胞术用于评价西施舌冻融精子成活率的可行性。结果表明伊红拒染法和PI拒染法呈显著正相关(r=0.954,P=0.003),两种方法均能有效检测西施舌精子的成活率,且相关性很好,但是PI-流式细胞术的精密性(CV为2.39％)要优于伊红拒染法实验(CV为4.67％),故流式细胞术适用于西施舌精子成活率的检测。
　　 采用流式细胞术,以质膜完整率即成活率为精子质量评价指标,研究抗冻剂,预冻速率和冷冻速率对西施舌精子超低温冷冻保存的影响。以一定的降温程序进行西施舌精子的超低温保存,研究二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)和丙二醇(PG)三种抗冻剂分别在1％、2.5％、4％、5％、10％、15％和20％时对西施舌精子质膜完整性及成活率的影响,结果仅4％、10％DMSO,2.5％、5％、15％EG和20％PG被选出用于预冻速率和冷冻速率的筛选。预冻速率分析以下5个速率:①1℃/min；②4℃/min；③6℃/min；④8℃/min⑤20±1℃10min,采用4℃/min的预冻速率可获得最佳的超低温冷冻效果,被用于冷冻速率的筛选。冷冻速率设置5个梯度:①0.25℃/min；②0.5℃/min；③1℃/min；④4℃/min,⑤直接投入液氮。35℃水浴解冻,流式细胞仪分析禹精子质膜完整性及成活率,以及进行人工受精验证,得出以15％EG为抗冻剂,4℃/min为预冻速率,4℃/min为冷冻速率,可获得最佳的成活率和受精率,分别为95.53％和52.32％。
　　 采用流式细胞术研究DMSO、EG和PG三种抗冻剂对西施舌冻融精子质膜完整性、细胞凋亡状况以及线粒体功能状态的影响,进而评价不同抗冻剂对西施舌冻融精子质量的影响,从而研究超低温冷冻保存对西施舌精子的冷冻损伤机理。结果表明,DMSO、EG、和PG三种抗冻剂对维持冻融精子的质膜完整性起到较好的作用,在一定程度上促进了冻融精子的凋亡进程,且不同抗冻剂及不同浓度的抗冻液对西施舌精子质膜完整性和细胞凋亡的影响不同,15％EG作为抗冻液,得到冻融精子的质膜完整率最高,早期凋亡率最低,分别为80.54％和7.99％；而且超低温冷冻保存过程降低了西施舌精子的线粒体活性,DMSO、EG和PG三种抗冻剂对维持西施舌冻精的线粒体活性起到了较好的保护作用,15％EG处理组的坏死精子比例最低,有线粒体功能的活性精子比例最高,分别为15.04％和81.32％。
　　 采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜分析比较超低温保存前后西施舌精子的外部形态和超微结构变化；并结合流式细胞术结果进行超低温冷冻损伤机理的研究。结果表明,扫描电镜下,西施舌冻融精子的顶体、线粒体损伤比较明显,精子头部表面呈不规则凹陷、鞭毛断裂甚至脱落等；透射电镜下西施舌冻融精子的质膜膨胀、破裂,顶体膜脱落、破裂。线粒体膜系统也受到破坏,线粒体解体、呈空泡状等。这些损伤表现与流式细胞术研究超低温冷冻保存对西施舌精子质膜完整性、细胞凋亡状态和线粒体功能的影响结果是相同的。由此可知,超低温冷冻保存过程造成了西施舌精子质膜、顶体、线粒体等处的不同程度的损伤。