西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存研究及冷冻损伤观察

摘要

西伯利亚鲟主要分布于鄂比河到科罗马河的所有大河中。我国养殖的西伯利亚鲟主要为以受精卵方式从俄罗斯引进，目前其养殖地位已经跃居我国各养殖鲟鱼种类之首，随着养殖技术的不断提高，现已在我国实现了全人工繁殖。然而，在我国野生种质资源匮乏的情况下长期人工繁殖，很可能产生种质退化，遗传多样性降低，抗病抗逆性能降低等现象。精子超低温冷冻保存使种质的长距离运输得以实现，以上问题便可迎刃而解。另外精子超低温冷冻保存也可用于杂交选育、提纯复壮、雄核发育等方面，对建立种质资源库，保护鲟鱼这种濒危物种也起到积极的指导作用。本文通过对鲟鱼精子生物学的研究，制定一套适合西伯利亚鲟精子冷冻保存简易方法。利用扫描和透射电镜对西伯利亚鲟精子冷冻前后形态和超微结构做了详细的研究，进一步探讨精子冷冻损伤的机理、评估精子保存的效果。 1.西伯利亚鲟精子生物学特性及冷冻保存方法 人工养殖7龄西伯利亚鲟产精量为113.67±39.86ml，精子密度为(6.49±3.10)×10<'8>/ml，精子活力为(85.4±9.5)％，精子寿命为353±23s，精浆渗透压为113±5.7mOsm/L。第二次和第三次产精质量优于第一次产精。精子密度与精子快速运动时间、精子寿命之间均存在线性相关，用方程分别表示为：y=1.0384x+1.5089(R<'2>=0.7325)；y=2.9069x+74.289(R<'2>=0.6967)。精子密度可作为一项精子质量评价的标准。不同离子对西伯利亚鲟精子活力影响很大，其中K<'+>对精子起抑制作用，而Na<'+>，Ca<'2+>，Mg<'2+>对精子起激活作用。通过比较西伯利亚鲟精子在不同稀释液、不同抗冻剂和抗冻剂浓度、降温速率、解冻温度下的保存效果，结果表明：以配方2作为保存精子的稀释液，用18％甲醇作为抗冻保护剂，采用二步法超低温(-196℃)冷冻保存精子，40℃水浴解冻精子，取得最好的冻精活力，冻后精子的活力为(51.8±5.8)％。西伯利亚鲟授精的最佳精卵比为10<'6>:1，冻精按此精卵比进行冻精授精，分别得到了(72.3±3)％的受精率和(52.9±4.1)％的孵化率，其中受精率与鲜精没有显著性差异，孵化率与鲜精有显著差异(P<0.05)。此冷冻方法可用于西伯利亚鲟的种质保存及遗传育种等方面。 2.西伯利亚鲟精子超微结构 西伯利亚鲟精子由一个明显的顶体，细胞核，中段和-根鞭毛组成，总长54.81±1.88μm。顶体呈帽状覆盖于精子顶端，顶体长0.64±0.09μm，宽0.86±0.10μm。顶体后端为8条螺旋状排列的后外侧延伸物，长0.32±0.04μm，与精核长轴夹角约30度。顶体此结构有助于种间精卵识别以及精卵识别后锚定卵子。项体内有颗粒物质。精核为前端细(0.78±0.13μm)后端粗(1.11±0.12μm)的棒状，长5.24.±0.39μm。核内有3条内切沟，始自植入窝螺旋状延伸至顶体。紧接精核的为中段，长1.83±0.26μm、宽0.72±0.10μm，内有中心粒复合体、线粒体等结构。近端中心粒为9组三联微管组成的风车状结构，近端中心粒与远端中心粒呈

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1.1低温生物学简介及损伤原理

1.1.1低温损伤原理

1.1.2精子冷冻保存的基本技术路线

1.2鱼类精子超低温保存的研究进展

1.2.1国内外研究现状

1.2.2精子生物学特征相关研究

1.2.3鲟鱼相关研究

1.3.研究意义及前景展望

1.3.1鱼类精液超低温冷冻保存技术的应用价值

1.3.2鱼类精液冷冻保存中存在的问题

第二章西伯利亚鲟精子生物学特性

2.1材料方法

2.1.1亲鱼来源

2.1.2配子采集

2.1.3精子活力标准

2.1.4精子基本性征观测

2.1.5最佳精卵比实验

2.2数据分析

2.3结果

2.3.1西伯利亚鲟精子生物学特征

2.3.2卵子受精最佳精卵比

2.4讨论

2.4.1西伯利亚鲟精子生物学特征

2.4.2不同阳离子和渗透压对西伯利亚鲟精子活力的影响

2.4.3西伯利亚鲟受精最佳精卵比

第三章西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存方法

3.1材料和方法

3.1.1精子采集

3.1.2超低温冷冻保存

3.1.3冻精授精实验

3.2数据分析

3.3结果

3.3.1抗冻剂对精子活力的影响

3.3.2稀释液对精子活力的影响

3.3.3降温及解冻方式对精子活力的影响

3.3.4冻精受精实验

3.4讨论

3.4.1西伯利亚鲟精子低温保存抗冻剂选择

3.4.2西伯利亚鲟精子对降、复温的适应能力

3.4.3冻精授精

第四章西伯利亚鲟精子超微结构和冷冻损伤观察

4.1.材料和方法

4.1.1精子取得

4.1.2冻精制备

4.1.3电镜观察

4.1.4测量及数据处理

4.2结果

4.2.1精子的外部形态

4.2.2精子的超微结构

4.3 讨论

4.3.1外部形态

4.3.2精子中心粒复合体与袖套中颗粒

4.3.3鞭毛

4.3.4精子超低温冷冻损伤

小结

图版

参考文献

致谢