扩展青霉TS414脂肪酶在毕赤酵母的表达、纯化及其催化外消旋萘普生酯化拆分的研究

摘要

本论文以扩展青霉TS414脂肪酶在毕赤酵母X-33的表达、纯化和重组扩展青霉TS414脂肪酶在有机相中催化外消旋萘普生酯化拆分为主线,开展了以下几个方面的研究:
　　 首先,优化了X33-TS414-lip工程菌的摇瓶发酵条件:pH为7.5、接种量为20D、甲醇浓度为0.75％、摇瓶装量为10％、转速为250rpm、温度为30℃。进一步在摇瓶优化的基础上考察三种不同的甲醇流加策略对该菌进行罐上产脂肪酶的影响。溶氧控制策略的酶活为104U/ml,酶产率为962U/l·h；变色酸法维持低浓度甲醇策略的酶活为443U/ml,酶产率为4614.58 U/l·h;甘油甲醇混合诱导过渡策略的酶活为573U/ml,产率为6821.43U/l·h,经优化后发酵策略的酶产率为溶氧控制策略的5.51倍。
　　 其次,重组扩展TS414脂肪酶发酵液经过饱和硫酸铵沉淀、Sephacryl S-100凝胶过滤层析、Phenyl Sepharose疏水层析三个纯化步骤后达到电泳纯,酶液的比酶活力由最初2988.03 U/mg提高至7909.74U/mg,提高了2.65倍,活性回收率为39.69％。重组TS414脂肪酶对外消旋萘普生的拆分效果与野生型脂肪酶相近。
　　 最后,确立固定化重组扩展青霉TS414脂肪酶酯化拆分萘普生的最佳反应条件:一、固定化条件:天津光复AB-8大孔吸附树脂、树脂与酶质量比为1:8、pH值为9.0、固定化吸附时间1.5h、冻干1 h；二、酯化拆分体系:固定化酶量为0.06g、外消旋萘普生量为1.48mg、正丙醇量为7.73μl、体系水含量为0.05％。在此条件下反应120h,转化率及产物对映体选择性分别达到48.27％和98.01％。固定化重组扩展青霉TS414脂肪酶酯化拆分萘普生的效果较理想。