甘蔗抗黑穗病性检测SCAR标记的建立

摘要

该研究的目的是建立可检测甘蔗黑穗病的SCAR标记.该文通过预备试验,优化了甘蔗RAPD反应组份和反应程序,建立了适于甘蔗的RAPD反应条件.采用随机引物PCR扩增,对杂交亲本Ya71-374、Co1001及其部分杂交后代进行了RAPD分析,筛选到与抗、感特异的多态性片段各一条,片段大小分别约为700bp和800bp.采用T-MD 18克隆载体,对700bp片段进行克隆,通过PCR和酶切鉴定,筛选阳性重组克隆子用于测序.测序结果显示该片段的实际长度为702bp,根据其两端的序列,设计了一对上、下游长度分别为23bp和22bp的引物,并对上述材料进行PCR检测.结果显示所有材料均扩增出一条702bp的条带,但感病亲本和病感个体中还扩增出一条长约400bp的多态性片段;初步研究还显示一组用于常规抗性鉴定的标准对照种也有类似的标记结果,从而将RAPD标记转化为SCAR标记,该SCAR标记有望用于甘蔗抗、感黑穗病基因型的鉴定.其上、下游引物的序列如下:上游引物:5'TTCCCCCGCTGCCCTCTTTTCTT3'下游引物:5'TTCCCCCGCTCGGACACCTGTT3'

目录

1前言

1.1甘蔗黑穗病的研究现状

1.1.1甘蔗黑穗病菌生理小种研究

1.1.2甘蔗抗黑穗病性鉴定技术与抗性评价方法

1.1.3甘蔗抗黑穗病性遗传的特点

1.2分子标记技术及标记辅助选择

1.2.1 RFLP

1.2.2 RAPD

1.2.3 AFLP

1.2.4 SSR

1.2.5 SCAR标记的特点及其应用

1.2.6目标性状连锁标记分析群体的构建方法

1.2.7甘蔗目标性状连锁标记研究

2材料与方法

2.1材料

2.1.1供试植物材料

2.1.2实验试剂及仪器设备

2.1.3菌株和质粒载体

2.1.4随机引物和特异引物

2.2方法

2.2.1人工接种与抗病性评价方法

2.2.2基因组DNA的提取和纯化

2.2.3 DNA浓度、纯度和质量的估测

2.2.4 RAPD标记分析法

2.2.5多态性DNA片段的回收

2.2.6感受态细胞的制备

2.2.7目的片段的连接与转化

2.2.8阳性克隆的鉴定

2.2.9重组质粒的保存

2.2.10 SCAR引物的设计与扩增

3结果与分析

3.1供试甘蔗材料人工接种鉴定结果

3.2甘蔗基因组DNA提取和定性定量分析结果

3.3 RAPD反应体系的建立

3.3.1 Mg2+浓度对PCR扩增的影响

3.3.2 dNTP浓度对PCR扩增的影响

3.4与目标性状连锁的多态性片段的获得

3.5特异多态性片段的回收与重扩增

3.6连接产物的转化结果

3.7重组质粒的筛选与鉴定

3.7.1 PCR扩增鉴定结果

3.7.2重组质粒的酶切鉴定结果

3.8多态性片段测序分析

4讨论

4.1 RAPD反应条件及反应体系的建立

4.2特异性RAPD标记S700的获得

4.3关于目的片段的克隆及测序

4.4 RAPD标记转换为SCAR标记的必要性

4.5关于SCAR标记检测

4.6关于本研究的特色

4.7关于后续工作

5结论

参考文献

致谢