大豆生物钟基因——ZEITLUPE同源基因的克隆及其功能分析

摘要

在植物的生长发育过程中，光照起了重要的作用。光不只是以能量的形式用于有机物质的合成，而且对植物来说是一种重要的外界信号，光暗的变化使植物感受外界的环境条件，调节自身的生长发育。光照的昼夜变化引起内源生物钟有节律的震荡，将外界的信息变化准确的传到植物体内。光信号和内源生物钟在植物由营养生长向生殖生长的转变中起了非常重要的作用，调节植物的生殖周期，有利于物种的延续和繁荣。 在光信号诱导生物钟形成的过程中，有许多重要的蛋白参与。其中拟南芥ZEITLUPE(ZTL)是新发现的调节开花时间和生物节律的一类蛋白家族，其家族成员的突变会影响昼夜节律和开花时间。 对这一类蛋白结构和功能的研究表明，它们可能是新的调节光周期反应和生物节律的光受体。此外，由于ztl突变体表现出光依赖的生物节律改变的表型，因此它可能是一个与生物钟密切相关的光受体。ZTL可以与生物钟中重要的成分TOC1相互作用，调节它被蛋白酶降解的过程，进而调节生物钟。同时，ZTL在体外可以和PHYTOCHROME(PHY)B和CRYPTOCHROME(CRY)1相互作用，它可能调节光受体向生物钟的信号输入。另外一个F-box蛋白FKF1(FLAVIN-BINDINGKELCHREPEATF-BOX1)在调节下游重要基因的表达上起重要作用。因此，ZTL家族的成员在光信号转导、生物节律控制和开花基因调节中起作用。 拟南芥的ZTL基因已进行了较为深入地研究，有关它是否起到光受体的作用也初步有了直接的证据，为了进一步研究这种蛋白的重要作用，了解它在生物钟和光周期调节开花中的作用，我们研究了同样是双子叶植物的大豆的ZTL基因。 在生活习性上，大豆与拟南芥相反，是典型的短日照植物，其对光周期反应极其敏感。本实验通过从NCBI的ESTs数据库中获得一组大豆ESTs(BM891117，BM523214,BQ297963,AW133198,BI701559,BI785775,BE800255,BE610497，BE660680)，用生物信息学的方法对这组序列进行比对、拼接，即采用ePCR的方法得到了ZTL同源序列。进而克隆了ZTL蛋白家族的一个同源基因GmZTL1(基因登录号为DQ371900)。 通过Gateway技术方法构建了GmZTL1基因的五个植物表达载体，使用的主要启动子是烟草花叶病毒35S启动子，主要包括：35S∷GmZTL1;35S∷Myc:GmZTL1；35S∷GFP:GmZTL1；35S∷GmZTL1:Myc；35S∷GmZTL1:GFP。其中过表达载体35S∷GmZTL1转化拟南芥野生型植株筛选得到了突变体，对突变体进行了后代植株的表型分析，发现转化后代有晚花表型，这与拟南芥ZTL的功能相似，说明尽管拟南芥与大豆的生活习性不同，然而ZTL基因的功能在两物种间很可能是保守的。 过表达载体35S∷GmZTL1转化拟南芥蓝光受体突变体和红光受体突变体也都得到了转化后代植株。为进一步分析GmZTL1基因与光受体之间的关系奠定了基础。 融合标签载体35S∷Myc:GmZTL1转化拟南芥野生型植株筛选得到了突变体，对其进行后代植株的表型分析，发现其转化后代也具有晚花表型。由于此载体含Myc标签，这为研究GmZTL1蛋白的功能提供了方便。 此外，本文摸索了大豆遗传转化体系，对其进行了部分优化，构建的GmZTL1基因的RNAi载体和过表达载体转化大豆品种垦农18，获得了T1种子。这对研究GmZTL1基因在大豆体内的功能也是一个很好的铺垫。 总之，本实验通过克隆GmZTL1基因、构建一系列植物表达载体、转化拟南芥和大豆植株，初步研究了GmZTL1基因的功能，并为其功能的深入研究作了充分准备。

目录

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摘要

缩略词

1.文献综述

2.材料与方法

3.结果与分析

4.结论

5.讨论

参考文献

附录

致谢