杉木种质资源遗传分析及无性系、杂交种ISSR指纹鉴定

摘要

杉木[Cunninghamialanceolata(Lemb)Hook]是我国南方特有的用材树种，具有生长快、材质好、产量高和用途广的特点，在南方林业生产中占重要地位，进行杉木遗传资源的收集、鉴定和遗传多样性分析具有重要现实意义。多年来不同学者对杉木地理种源遗传变异规律进行了大量研究，取得了很多研究成果，但目前的研究以不同地理种源杉木的形态学、生理学、生态学方面的研究居多，从分子生物学方面进行的研究相对较少，至今仍未从分子机理上弄清不同种源杉木的遗传变异规律及种群分布格局。加上近年来大量野生杉木种质资源被破坏，各地造林的杉木种子的种源、无性系来源不清和杉木造林材料管理混乱，目前尚无法通过外部形态、生理学及细胞标记方法进行鉴别。 针对目前杉木育种工作中存在的以上问题，本研究选择全国24个杉木地理种源、9个杉木优良无性系和6个亲本及其杂交子代为研究材料，首次利用多态性、重复性及检测遗传差异能力均优于RAPD的ISSR分子标记技术，进行不同杉木地理种源的遗传分析及无性系、杂交种的ISSR指纹鉴定，分析不同种源杉木的遗传背景、遗传结构及种源间的亲缘关系，探讨利用ISSR标记技术鉴别杉木无性系及杂交种的可行性，从分子水平上揭示不同种源杉木的遗传变异规律及种群分布格局，为合理杉木地理种源区划和育种方案制定、优良无性系及其杂交种鉴定、纯度分析及优良种质资源管理提供分子方面的依据。主要研究结果如下： (1)针对杉木含有色素、酚类化合物和多糖等物质导致DNA提取和纯化困难的现实，采用经过改良的SDS法提取的杉木DNA，不论从数量还是纯度上均可满足ISSR分析要求，且操作简便易行，摸索到了合适的杉木DNA提取方法。 (2)研究建立了杉木ISSR-PCR反应的技术体系。在20ul的反应体系中，Mg2+的浓度为1.5mmol/L，TaqDNA聚合酶的用量为1U，引物的浓度为0.75umol/L，dNTP的浓度为100umol/L，模板DNA的浓度为100ng/反应，2.0ul10×PCR缓冲液。按照此体系，在94℃预变性7min，94℃变性30s，在55℃的退火温度下退火40s，72℃延伸2min，进行40个循环，循环结束后72℃延伸7min。 (3)通过对100个引物筛选，共得到了22个扩增带型清晰、稳定的ISSR引物，进行杉木种质资源的遗传多样性分析；同时研究中发现含(AG)8、(AC)8、(CT)8序列的ISSR引物在杉木上扩增的多态性水平较高。 (4)从100个ISSR随机引物中筛选出22个引物对24个杉木种源进行扩增，共扩增出188条谱带，其中多态谱带173条，占总数的92.0％。表明杉木不同地理种源具有丰富的遗传多态性。聚类分析将24个杉木种源分为五个类群：分布区中带东区生态型、中带东南区生态型、中带中区生态型、南带生态型、北带生态型。杉木地理种源遗传距离聚类结果与地域分布基本一致，表明杉木地理种源具有一定纬向倾群变异性，环境条件和地理距离隔离是影响杉木地理种源遗传变异的重要因子。 (5)利用18个ISSR引物对9个杉木无性系进行了ISSR-PCR分析，共得到161条扩增带，其中145条带表现为多态带，占总带数的90.06％，平均每个引物扩增出8.06条清晰的特异条带。由这18个引物扩增出的片段大部分集中在500bp至2000bp。杉木无性系间表现出了丰富的遗传多态性。仅用引物(CTTCA)3、(AC)8G、(AG)8(CT)A中的任一个构建的指纹图谱就能将供试的9个杉木无性系清楚区分开。18个引物中大多数引物两两结合就能够将9个杉木无性系清楚的区分开。可见ISSR扩增的谱带丰富、多态水平高。 (6)利用筛选出的22个ISSR引物对父本YK48、母本YK8及其杂交种DNA进行了PCR扩增，6个引物未扩增出条带，16个引物扩增出2～13条带，分子量在150～2000bp之间，其中偏母型引物、偏父型引物、互补型引物、特异型引物及缺失型引物依次为4、3、2、2、3条。其余2条为同型引物。并利用互补型引物U848分析了杉木杂种纯度，通过人为混杂验证了ISSR技术用于杂种纯度检测是可行的。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

独创性声明及论文使用授权的说明

1前言

2国内外研究概况

3材料与方法

4结果与分析

5讨论

6结论

参考文献

致谢